银杏叶提取物抗猪链球菌2型溶血素活性研究

为了筛选猪链球菌溶血素抑制剂并探讨其体外抗猪链球菌感染的作用效果,试验采用溶血试验、最小抑菌浓度测定、生长曲线测定、Trans well小室穿膜试验和细胞毒性试验等方法对其银杏叶提取物进行研究。结果表明:银杏叶提取物在较低浓度时可直接中和猪链球菌培养物上清液介导的成孔活性;在猪链球菌与宿主细胞共感染体系内加入银杏叶提取物可显著降低猪链球菌穿透上皮细胞屏障的能力及细菌介导的细胞毒性作用。说明银杏叶提取物是一种潜在的抗猪链球菌感染药物。     

重组单增李斯特菌溶血素O在大肠杆菌中的分泌表达及活性分析

单增李斯特菌是食源性致病菌,常引起人和动物的生殖障碍,由此菌分泌的溶血素O(LLO)是重要的致病因子。为研究LLO对细胞的毒性作用及对动物体生殖免疫的调节作用,需要制备大量重组LLO。为此本试验依据LLO基因序列(JN703918)通过PCR方法从单增李斯特菌菌株基因组中扩增无信号肽的LLO编码基因,然后将其插入到pET-20b(+)质粒中,使其5′端与载体中的pelB信号肽序列融合,3′端与His-标签融合,构建成LLO分泌性原核表达载体pET-20b-LLO/H。将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,在IPTG的诱导下进行表达,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶从细菌周质释放液中提取和纯化重组LLO蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。利用溶血试验检测重组蛋白的生物活性。结果表明,本试验扩增的LLO基因序列与GenBank中的LLO基因序列完全一致。采用分泌性表达策略实现了重组LLO在大肠杆菌中的分泌表达,并且表达的重组LLO具有明显的溶血活性。     

四甲基吡嗪对獭兔单增李斯特菌感染和天然免疫的影响

本试验通过研究四甲基吡嗪(TMP)对单增李斯特菌感染獭兔载菌量、溶血素、促炎因子(TNF-α、IL-1β和IFN-γ)、免疫器官指数和天然抗体的影响,旨在探讨TMP对单增李斯特菌的抑菌作用。选择断奶獭兔180只随机分为5组,每组6个重复,每个重复6只。对照组饲喂基础日粮,其他4组在基础日粮中分别添加0、50、100、150 mg/kg TMP。饲养试验第1天,4个试验组獭兔每只灌服1 mL(10~7 CFU)单增李斯特菌株,对照组灌服无菌株的培养液,饲养试验持续14 d。结果表明,TMP降低了獭兔肝脏、脾脏和淋巴结的单增李斯特菌载菌量(P0.05)。盲肠食糜、肝脏、脾脏和淋巴结载菌量均呈线性下降(P0.05)。添加TMP使獭兔李斯特菌溶血素和促炎因子(TNF-α和IL-1β)显著降低(P0.05),14 d时,李斯特菌溶血素呈线性下降(P0.05),促炎因子(TNF-α和IL-1β)均呈现线性和平方下降(P0.05)。胸腺指数、脾脏指数、血清IgA和IgG在单增李斯特菌感染后下降,随TMP添加量增加而增加,但只有饲喂至7 d时的脾脏指数呈线性上升(P0.05)。说明日粮中添加TMP可以降低单增李斯特菌感染獭兔组织载菌量,减少单增李斯特菌的毒力,对提升免疫器官指数和天然抗体有积极作用。     

黄芩提取物对猪链球菌溶血素抑制作用的试验

为了治疗和控制猪链球菌病,本文通过最小抑菌浓度、生长曲线的测定以及溶血试验等筛选针对猪链球菌溶血素(Suilysin,SLY)的抑制剂,研究发现较低浓度的黄芩提取物对猪链球菌几乎没有抗菌活性,但可以显著抑制猪链球菌SLY所诱导的溶血活性;并且黄芩提取物可以显著降低猪链球菌感染所引发的细胞损伤;此外,体内研究发现,黄芩提取物可降低猪链球菌感染小鼠的死亡率。综上,本研究结果表明,黄芩提取物可以通过抑制SLY的生物活性而在猪链球菌感染中发挥治疗作用,是一种具有开发价值、治疗猪链球菌感染的先导复合物。     

姜黄提取物对猪链球菌溶血素活性的影响

猪链球菌的致病力发挥与其携带或分泌的多种毒力因子有着密切的联系。通过选择猪链球菌毒力因子作为作用靶点,可为控制和治疗猪链球菌感染提供新的研发思路。本试验通过对猪链球菌最小抑菌浓度和细菌生长曲线测定等试验方法研究发现,低浓度姜黄提取物几乎不影响猪链球菌增殖,但是可以明显中和猪链球菌溶血素所介导的溶血活性;在体外猪链球菌感染宿主细胞试验中,姜黄提取物可显著降低猪链球菌穿透上皮细胞屏障的通透率,并可缓解其介导的细胞损伤和毒性作用。研究结果表明,姜黄提取物可抑制猪链球菌溶血素活性、降低猪链球菌毒力,提示姜黄提取物可作为一种治疗和控制猪链球菌感染的潜在先导天然复合物。     

单增李斯特菌膜裂解相关基因缺失突变株的构建及生物学特性鉴定

拟探明单核细胞增多性李斯特菌(单增李斯特菌)分离株M7可能的低致病力机制。利用SOE-PCR及同源重组法构建M7膜裂解相关基因hly及plcB单缺失(M7-Δhly和M7-ΔplcB)及双缺失突变株(M7-Δhly/plcB),比较它们与亲本株的生物学特性差异。结果如下:PCR及反转录PCR表明突变株构建成功。突变株M7-Δhly和M7-Δhly/plcB因hly缺失致其溶血活性丧失。plcB缺失突变株M7-ΔplcB和M7-Δhly/plcB无可见溶脂活性。单缺失突变株M7-ΔplcB、M7-Δhly与M7具有相似的细胞黏附及增殖能力(P0.05)。MOI为1 000时,双缺失突变株M7-Δhly/plcB对Caco-2细胞毒性最低(11.10%),M7-Δhly次之(23.53%)(P0.05)。空斑试验表明菌株M7和M7-ΔplcB仅能在无庆大霉素培养基中形成空斑。hly及plcB缺失致单增李斯特菌对免疫抑制小鼠毒力降低。单增李斯特菌M7低致病力可能与hly及plcB的高水平表达有关,致细菌对宿主细胞毒性增强而从细胞内逸出,使其不能躲避宿主免疫系统而被清除。     

分子伴侣prsA2基因缺失对单增李斯特菌致病性的影响

【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失...     

食品中金黄色葡萄球菌单增李斯特氏菌和副溶血性弧菌的MPCR法检测

为快速检测食品中的金黄色葡萄球菌(SA)、单增李斯特氏菌(LM)和副溶血性弧菌(VP),根据各菌的相关基因设计引物,分别扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因-nuc、单增李斯特氏菌溶血素O上的hlyA基因和副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素基因-tdh,建立一种MPCR快速检测食品中致病菌的方法,结果表明,三条特异性扩增片段分别为279bp、243bp和202bp,经DNA测序证明其序列与模板被扩增片段一致。该方法具有良好的灵敏性和特异性。     

黄芩提取物抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性的研究

α-溶血素(αHL)是金黄色葡萄球菌(S.aureus)重要的毒力因子,为研究黄芩醇提物对αHL溶血活性的抑制作用,本研究通过乙醇回流提取法获得黄芩醇提取物,测定其对S.aureus的最小抑菌浓度(MIC)、对αHL表达和生物学活性的影响以及对αHL介导的A549细胞损伤的保护性作用.试验结果显示,黄芩醇提取物对所测试的S.aureus的MIC均高于2048 μg/mL;黄芩醇提取物能够抑制S.aureus培养物上清中的αHL的溶血活性,并呈浓度依赖关系,但对αHL的表达并无抑制作用;而且黄芩醇提取物也能够呈剂量依赖关系缓解S.aureus αHL介导的对A549细胞损伤作用.该结果表明黄芩醇提取物能够以某种形式导致αHL丧失生物活性,并提示黄芩醇提取物是一种潜在的抗S.aureus感染的复合物.     

四甲基吡嗪对獭兔单增李斯特菌感染和天然免疫的影响

本试验通过研究四甲基吡嗪（TMP）对单增李斯特菌感染獭兔载菌量、溶血素、促炎因子（TNF-α、IL-1β和IFN-γ）、免疫器官指数和天然抗体的影响,旨在探讨TMP对单增李斯特菌的抑菌作用。选择断奶獭兔180只随机分为5组,每组6个重复,每个重复6只。对照组饲喂基础日粮,其他4组在基础日粮中分别添加0、50、100、150 mg/kg TMP。饲养试验第1天,4个试验组獭兔每只灌服1 mL（10⁷ CFU）单增李斯特菌株,对照组灌服无菌株的培养液,饲养试验持续14 d。结果表明,TMP降低了獭兔肝脏、脾脏和淋巴结的单增李斯特菌载菌量（P<0.05）。盲肠食糜、肝脏、脾脏和淋巴结载菌量均呈线性下降（P<0.05）。添加TMP使獭兔李斯特菌溶血素和促炎因子（TNF-α和IL-1β）显著降低（P<0.05）,14 d时,李斯特菌溶血素呈线性下降（P<0.05）,促炎因子（TNF-α和IL-1β）均呈现线性和平方下降（P<0.05）。胸腺指数、脾脏指数、血清IgA和IgG在单增李斯特菌感染后下降,随TMP添加量增加而增加,但只有饲喂至7 d时的脾脏指数呈线性上升（P<0.05）。说明日粮中添加TMP可以降低单增李斯特菌感染獭兔组织载菌量,减少单增李斯特菌的毒力,对提升免疫器官指数和天然抗体有积极作用。     

单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究

为分析单增李斯特菌溶血素S(listeriolysin S,LLS)llsB基因缺失对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性的影响,本研究利用同源重组构建了llsB基因缺失株LM90-ΔllsB,并以8周龄、体重40g±5g的健康昆明系雄性小鼠为试验动物对其生长特性、半数致死量(LD50)、脏器载菌量等生物学特性进行了初步研究。结果显示,本研究成功构建了llsB基因缺失株;缺失株在体外连续培养20代过程中能稳定遗传。通过生长曲线测定发现,llsB基因缺失株生长活性略高于亲本株;小鼠感染试验结果显示,亲本株和缺失株的LD50分别为106.17和106.50 CFU;与亲本株相比,缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的载菌量均极显著减少(P0.01),说明缺失株对小鼠的感染能力明显减弱。在小鼠脑中未检出单增李斯特菌。综上所述,llsB基因对LM90的部分生物学特性可能有直接或间接的调控作用,本试验结果为进一步研究LLS的致病机理及防控李斯特菌病提供一定的理论依据。     

单核细胞增生李斯特菌SigB调控GadD3的抗酸应激作用

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性人兽共患病病原菌,其拥有一系列抗酸应激系统以抵抗酸应激的伤害作用。谷氨酸脱羧酶(GAD)系统是该菌抗酸应激系统重要成员之一,酸应激存活试验表明,GAD系统3个谷氨酸脱羧酶基因对单增李斯特菌抗酸应激能力的贡献依次为gadD2、gadD3和gadD1。为阐明GAD系统抗酸作用调控机制,通过荧光定量PCR、GFP报告基因和免疫印迹结合酸应激存活试验,证实了应激调控因子SigB参与正调控gadD3的转录与表达,但是不影响gadD1和gadD2的表达,进而通过gadD3参与单增李斯特菌的抗酸应激作用。研究结果丰富了单增李斯特菌抗酸应激系统的调控网络,并可为李斯特菌病的防控提供理论依据。     

单核细胞增生李斯特菌溶血素hly基因缺失株和回补株的构建

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰染色阳性菌,在人类与动物生活环境中均广泛分布,为人畜共患病原菌。李斯特菌溶血素O(LLO,由hly编码)作为李斯特菌重要毒力因子主要在细菌裂解并逃逸吞噬体中起作用,但其潜在的分子机制尚待深入解析。以单增李斯特菌EGD-e为参考菌株,通过PCR分别扩增hly基因的上、下游同源臂序列(各约500bp),选用SOE PCR方法将同源臂整合连接成融合片段。经BamHⅠ/SalⅠ酶切、连接后克隆至李斯特菌温敏型穿梭质粒pKSV7中得到重组质粒pSL081,测序验证后电转至EGD-e感受态细胞中,在温度变化及抗生素双重选择压力下筛选获得hly基因缺失株Δhly。同时,设计引物扩增含hly基因启动子和编码区序列的片段,克隆至李斯特菌整合型质粒pIMK2中得到重组质粒pSL251,测序验证后电转至缺失株Δhly感受态细胞中,经抗性筛选获得回补株CΔhly。测序结果显示,缺失株Δhly和回补株CΔhly均构建正确。利用Western blot方法检测突变株中LLO的表达情况,结果显示EGD-e和CΔhly中均能检测到LLO的正常表达,而Δhly中无法检测到,进一步证实成功构建了hly基因缺失株和回补株,为下一步深入探索LLO在李斯特菌感染过程中的生物学功能奠定了基础。     

单增李斯特菌InlB的原核表达与多克隆抗体制备

为了进一步研究单增李斯特菌分泌的细菌侵袭相关蛋白内化素B(InlB)的功能,试验通过原核表达载体pET-28a分别表达InlB的N36～321和C392～630,并通过Ni~(2+)亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,纯化的蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,通过Western-blot检测单增李斯特菌InlB的表达情况。结果表明:成功构建重组表达质粒及诱导表达重组蛋白,制备的针对InlB N端和C端的多克隆抗体均能特异性检测单增李斯特菌中的InlB,但不能通过免疫荧光检测该菌表面的InlB。说明本研究制备的多克隆抗体可进一步用于研究单增李斯特菌InlB的功能。     

单增李斯特菌双元调控系统hssS/hssR缺失株的构建及其生物学特性

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种重要的食源性人畜共患病原菌,可抵抗外界多种不利因素的影响,如酸、碱、渗透压和氧化应激.双元调控系统(two-component system,TCS)是细菌适应环境的重要调控系统,为了探明双元调控系统HssS/HssR对单增李斯特菌抗应激能力及毒力...     

单增李斯特菌在乳粉中的生存特性

单增李斯特菌是乳粉中常见的致病菌之一。为了解不同水活性（Aw）干乳粉、复水乳粉和热冲调乳粉中单增李斯特菌的生存特性，通过人工方法将单增李斯特菌添加于不同Aw的干奶粉、复水奶粉中，并在不同温度或pH条件下培养，通过菌落计数来分析单增李斯特菌的生存特性。结果显示：在4 ℃条件下，单增李斯特菌可在较低Aw（0.81、0.92）的干奶粉中长期保持生长活力，并且当Aw较高（0.96）时，会有增长趋势；在25 ℃条件下，干奶粉中的单增李斯特菌的生长活力很快减退，细菌处于亚损伤状态。复水奶粉中的单增李斯特菌能够生长的温度为-1.5~37 ℃，在pH4.4~8.0的复水奶粉中，高温条件下（30 ℃）比在低温条件下（4 ℃）生长快，但在低温条件下，对酸碱的耐受程度比在高温条件下大。单增李斯特菌在复水的高糖高脂奶粉中比原料奶粉中对热的耐受力强。结果表明，高温条件更易使干奶粉中单增李斯特菌生长活力减退，复水奶粉如果污染单增李斯特菌，在低温条件下贮存则能够控制单增李斯特菌的生长，高糖高脂成分可提高单增李斯特菌的热抵制能力。本研究为乳粉中单增李斯特菌的风险评估和关键控制措施的制定提供了依据。     

食源性单增李斯特菌的分离鉴定及药物敏感试验

为了了解常规送检食物中单增李斯特菌的污染现况和分离株的药物敏感性,对2014年新疆生产建设兵团8个师常规送检的727份食品应用国标法进行细菌分离鉴定,采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法进行药物敏感试验。结果显示,从727份食品样品中分离出24株细菌,经革兰染色,培养特性和生化特性鉴定为单增李斯特菌。食品单增李斯特菌总检出率为3.3%,其中调理肉制品检出率最高,达17.77%,其次是冷冻鱼糜制品,检出率为4.95%。药敏试验表明, 24株单增李斯特菌对青霉素和环丙沙星耐药;大部分菌株对亚胺培南、强力霉素、万古霉素和庆大霉素敏感。表明送检食品不同程度受到单增李斯特菌的污染,食源性分离菌株出现多重耐药现象,提示食品安全不容忽视。     

单增李斯特菌溶血素LLS/LLO缺失株的构建及小鼠免疫保护性研究

旨在探究单增李斯特菌溶血素S/O(LLS/LLO)对单增李斯特菌(LM)的部分生物学特性影响及单增李斯特菌溶血素S/O基因缺失株的免疫原性。利用同源重组技术在本实验室已成功构建并保存的LM90SB2Δlls菌株基础上构建LM90SB2Δlls-Δllo,并绘制LM90SB2和LM90SB2Δlls-Δllo的生长曲线，测定半数致死量(LD₅₀)、组织载菌量(同时采用灌服和腹腔注射方式)等，进行小鼠免疫保护性研究，分析溶血素基因llsB/hly缺失对LM的生长特性以及毒力的影响。结果：成功构建LM90SB2Δlls-Δllo缺失株，且能在体外稳定遗传。测定生长曲线，LM90SB2的生长活性略高于LM90SB2Δlls-Δllo; LM90SB2的LD₅₀为3.65×10^7.23 CFU,LM90SB2Δlls-Δllo的LD₅₀大于2.7×10⁹ CFU;通过灌服及腹腔注射，与LM90SB2相比，LM90SB2Δlls-Δllo在小鼠脑、肝、脾中的载菌量均明显减少，差异极显著(P...     

进口冷冻鸡翼尖中单增李斯特菌的分离与鉴定

单增李斯特菌是革兰氏阳性短小杆菌,菌毒性很大,耐热。在自然界中具有细胞内寄生能力。单增李斯特菌可污染奶、奶制品、肉类、水产品和新鲜蔬菜。单增李斯特菌病的发生多与摄入该菌污染的食品有关。它是一种重要的人畜共患病的病原菌,能引起人和动物发病,感染可致败血症、脑膜炎、坏死性心肌炎、坏死性肝炎及流产等疾病。病死率高达30％以上,严重威胁着我国畜牧业生产安全和人类健康。近年来在世界许多港口被检测到。并造成一定的经济损失。目前该菌被国家质检总局列为进出口食品的必检菌或监控病原菌。     

亚抑菌浓度穿心莲提取物对减缓金黄色葡萄球菌α-溶血素介导的A549细胞损伤作用的影响

金黄色葡萄球菌是一种广泛存在的重要致病菌,可引起人类和动物许多严重的感染。另外,α-溶血素是金黄色葡萄球菌最重要的毒力因子之一。本研究通过乙醇回流提取方法,获得中草药穿心莲提取物,然后通过最低抑制浓度(MIC)值测定、溶血活性测定、Western blotting、RT-PCR、LDH及Live/dead等方法研究分析穿心莲提取物对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的影响及对A549细胞的保护作用。试验结果表明,穿心莲提取物对金黄色葡萄球菌的MIC值为2048 μg/mL,且呈剂量依赖性地抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌,并能有效减缓金黄色葡萄球菌菌液上清对A549细胞的损伤。提示,穿心莲提取物是一种潜在的抗金黄色葡萄球菌感染的药物。