单增李斯特菌双元调控系统lmo1060/lmo1061缺失株的构建及其抗酸应激能力

为了探明双元调控系统Lmo1060/Lmo1061是否影响单增李斯特菌(LM)的抗应激作用及致病性,本研究以LM 10403S为亲本株,通过同源重组技术构建了 Δlmo1060/lmo1061缺失株.应激存活试验结果表明,lmo1060/lmo1061缺失显著增强LM在酸应激(pH=2.5)条件下的存活率,但不影响该菌...     

单核细胞增生李斯特菌SigB调控GadD3的抗酸应激作用

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性人兽共患病病原菌,其拥有一系列抗酸应激系统以抵抗酸应激的伤害作用。谷氨酸脱羧酶(GAD)系统是该菌抗酸应激系统重要成员之一,酸应激存活试验表明,GAD系统3个谷氨酸脱羧酶基因对单增李斯特菌抗酸应激能力的贡献依次为gadD2、gadD3和gadD1。为阐明GAD系统抗酸作用调控机制,通过荧光定量PCR、GFP报告基因和免疫印迹结合酸应激存活试验,证实了应激调控因子SigB参与正调控gadD3的转录与表达,但是不影响gadD1和gadD2的表达,进而通过gadD3参与单增李斯特菌的抗酸应激作用。研究结果丰富了单增李斯特菌抗酸应激系统的调控网络,并可为李斯特菌病的防控提供理论依据。     

糖基翻转酶gtcA基因缺失降低单增李斯特菌1/2a血清型菌株致病性的研究

【目的】 构建糖基翻转酶gtcA基因缺失株，并阐明其对单增李斯特致病性的影响。【方法】 利用同源重组技术构建gtcA基因缺失株；进一步分析亲本株EGDe-prfA*、缺失株ΔgtcA和回补株CΔgtcA的生长能力；通过Western blotting分析gtcA基因缺失对InlA和InlB在细菌表面锚定的影响；通过DF1细胞黏附侵袭试验、RAW264.7细胞吞噬增殖试验和鸡胚毒力试验评估gtcA基因缺失对单增李斯特菌细胞侵染能力及对鸡胚致病性的影响。【结果】 生长曲线显示，gtcA基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。Western blotting结果显示，内化素InlB在ΔgtcA表面的锚定量极显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.01），但其表面InlA的锚定量与EGDe-prfA*并无显著差异（P>0.05）。细胞黏附侵袭试验结果显示，ΔgtcA对成纤维细胞DF1的平均黏附率和侵袭率显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.05）。吞噬试验结果显示，巨噬细胞RAW264.7对ΔgtcA的平均吞噬率显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.05），但ΔgtcA与EGDe-prfA*、CΔgtcA在RAW264.7中的3 h内增殖倍数并无显著差异（P>0.05）。鸡胚毒力试验结果显示，ΔgtcA感染鸡胚肝脏和脾脏中的平均细菌载量分别为6.86×10³和3.69×10² CFU，极显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA感染鸡胚（P<0.01）；同时，ΔgtcA感染鸡胚存活率及存活时间均高于EGDe-prfA*和CΔgtcA感染鸡胚。【结论】 糖基转移酶gtcA基因缺失不影响单增李斯特菌1/2a血清型菌株EGDe-prfA*的生长能力，但能显著降低该菌表面InlB的锚定丰度，减弱该菌的细胞侵染能力及对鸡胚的致病性。本研究结果为深入探索糖基翻转酶基因gtcA介导单增李斯特菌致病机制提供参考。     

分子伴侣prsA2基因缺失对单增李斯特菌致病性的影响

【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失...