高致病性PRRS活疫苗(HuN4-F112株)抗体对Ⅱ型不同亚群PRRSV的中和效果

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)活疫苗(HuN4-F112株)诱导的抗体对II型不同亚群PRRSV的中和作用,本研究将10头PRRSV抗原、抗体阴性的6周龄仔猪,每头仔猪肌肉注射1头份疫苗(106.0TCID50/mL),每周采血并分离血清,检测该血清对II型PRRSV第1、2、4亚群的代表病毒株勃林格PRRSV活疫苗(VR-2332株)、PRRSV活疫苗(CH-1R株)和HP-PRRSV活疫苗(HuN4-F112株)的中和效价。实验结果显示,仔猪免疫3周后开始产生针对HuN4-F112的中和抗体,11周至22周抗体水平达到高峰,抗体持续至少25周,但只有少数免疫猪在几个时间点的血清对VR-2332和CH-1R疫苗株具有血清交叉中和作用,而且中和效价较低。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F112株）对类NADC30 PRRSV免疫保护效果的评价

类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)已成为我国PRRSV的主要流行株,为了评价当前商品化疫苗对类NADC30 PRRSV的免疫保护效果,本研究将12头6周龄仔猪随机分为3组,免疫组和攻毒对照组各5头、空白对照组2头,免疫组肌注高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)105.0TCID50/头,免疫后21 d,免疫组和攻毒对照组每头各肌注2 mL和滴鼻2 mL类NADC30 PRRSV SD53-1603株(104.0TCID50/mL)。攻毒后观察各组实验猪临床症状,可见攻毒对照组所有猪均发热,持续5 d~9 d,免疫组仅2头猪发热1 d~2 d。检测各组实验猪体重变化,结果显示,攻毒后免疫组和攻毒对照组体重增长均显著低于空白对照组(p0.001),但攻毒14 d以后,免疫组体重增长显著高于攻毒对照组(p0.05)。IDEXX ELISA测定各组猪血清中PRRSV的特异性抗体,结果显示免疫后14 d可以诱导免疫组仔猪产生良好的针对PRRSV的特异性抗体。利用荧光定量PCR测定血清和组织中的病毒载量,结果显示免疫组血清和组织中的病毒载量均极显著低于对照组(p0.0001)。对PRRSV免疫后及攻毒后各组仔猪各脏器病理学观察,结果可见攻毒对照组与免疫组相比出现明显的剖检和组织病理学变化。以上结果表明,高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)对类NADC30 PRRSV可以提供一定的交叉保护,该研究为评价我国现有疫苗是否对类NADC30 PRRSV具有保护效果提供了参考依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株最小免疫剂量的测定

将35头40日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)抗原及抗体均为阴性的健康仔猪,随机分成7组,每组5头,命名为XJ1~XJ7组。XJ1~XJ6组分别免疫PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株,接种剂量分别为102TCID50/头、103TCID50/头、104TCID50/头、105TCID50/头、106TCID50/头和107TCID50/头,XJ7组为对照组,按1mL/头剂量接种DMEM。各试验组在免疫后28 d,用3×104.0TCID50/头剂量感染HP-PRRSV HuN4第5代强毒,疫苗免疫和攻毒后观察和检测各组试验猪的免疫效果。结果表明:攻毒前XJ2-XJ6组PRRSV ELISA抗体在免疫后14 d全部转为阳性,XJ1组在免疫后21 d转为阳性,但维持在较低水平;XJ2-XJ6组针对标记基因NP49的特异性抗体在免疫后28 d转阳性。攻毒后对照组全部发病,且死亡2头,XJ1有4头发病,XJ2-XJ6组无发病和死亡,本研究结果表明PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株对仔猪提供免疫保护的最小免疫剂量为103TCID50/头。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白B表位诱导中和抗体能力的研究

为证实GP5蛋白B表位是否具有诱导抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中和抗体的能力,本实验合成了PRRSV CH-la株和高致病性PRRSV(HP-PRRSV)HuN4株B表位的短肽,分别免疫家兔制备两份特异性多肽抗血清.此外,将12头PRRSV及其抗体均为阴性的健康仔猪以HP-PRRSV HuN4疫苗毒株(HuN4-F112)进行基础免疫,然后用强毒株(HuN4-F5)进行多次接种,制备猪高免血清.间接免疫荧光检测(IFA)结果显示,两份多肽抗血清均能与PRRSV经典株和变异株发生特异性反应,IFA抗体效价无差异,表明两份血清没有显著差异.病毒中和试验结果表明,两份多肽抗血清均不具有中和PRRSV活性.间接ELISA和病毒中和试验结果表明,猪高免血清中针对B表位肽的ELISA抗体水平与血清抗PRRSV中和抗体之间没有正相关关系,而且B表位肽不能抑制中和抗体.以上结果表明HP-PRRSV B表位不能诱导产生中和抗体.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112株在Marc-145细胞上最佳增殖条件的研究

为了在Marc-145细胞上获得更高滴度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HuN4-F112株,优化了细胞培养条件、病毒接种剂量、收毒时间和病毒液冻融次数等条件。结果证明Marc-145细胞在MEM培养基、新生牛血清含量8%、细胞接毒密度1.5×105个/mL、pH7.1条件下生长状态最好;PRRSV HuN4-F112株的最佳接种剂量为3.0×105 TCID50/mL,收毒时间为接种后70～72小时,在-18℃冻融3次,PRRSV HuN4-F112株增殖效果最好。该结果为HuN4-F112株PRRSV疫苗的生产提供了依据。     

PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗免疫特性的研究

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株疫苗的免疫机理和明确PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗各自的免疫特性,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫PRRSV抗原和抗体阴性的健康断奶仔猪,免疫后21d用PRRSV变异株HuN4强毒攻毒,ELISA方法检测血清中PRRSV特异的抗体水平及TNF-α、IFN-α、IL-1、IL-6和CRP细胞因子水平,荧光定量RT-PCR方法检测病毒血症的发生和持续情况,并取主要器官进行病理组织学观察。结果表明:HuN4活疫苗组免疫后14d便可检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d各细胞因子水平升高,攻毒后21d病毒血症完全消失,免疫后各器官没有明显病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化轻微;JXA1株灭活苗组免疫期间没有检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d～9d各细胞因子水平升高,攻毒后病毒血症持续存在,免疫后各器官有轻微病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化比HuN4活疫苗组严重,但比对照组明显减轻。本实验表明,HuN4活疫苗能够快速有效的激发机体的体液免疫反应,在抵抗PRRSV变异株HuN4强毒攻毒时,临床症状明显优于JXA1灭活苗。     

重组猪γ干扰素对猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗免疫效果的影响

为了研究重组猪γ干扰素(r Po IFN-γ)对疫苗免疫效果的影响,试验选取35日龄健康仔猪16只,随机分为4组,1组为对照组,2,3,4组为试验组。各组均免疫PRRS弱毒疫苗1头份,同时1组分点肌肉注射生理盐水4 m L/头;2,3,4组分别分点肌肉注射r Po IFN-γ注射液4万单位(4 m L)/头、40万单位(4 m L)/头、400万单位(4 m L)/头,研究r Po IFN-γ对PRRS弱毒疫苗血清ELISA抗体和中和抗体产生的影响。结果表明:在免疫PRRS弱毒疫苗后第14天,3组ELISA抗体水平显著高于其他组(P0.05);试验至第35天,2,3,4组ELISA抗体水平显著高于1组(P0.05)。免疫PRRS弱毒疫苗21 d后,试验组血清中和抗体水平高于对照组,但各组差异不显著(P0.05)。说明肌肉注射一定剂量r Po IFN-γ增强了疫苗免疫效果。     

高致病性猪蓝耳病活疫苗免疫效果比较研究

为了对高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HP-PRRS)免疫效果进行比较,选择辽宁地区某养殖场临床健康仔猪60头,随机分为Ⅰ组和Ⅱ组,两组仔猪均于30日龄首次免疫某厂家的HuN4-F112株活疫苗,Ⅰ组于60日龄进行加强免疫,两组均于180日龄进行最终免疫,每次免疫后30 d采集血样,进行PRRSV抗体水平检测,两组在首免后30日检测抗体,未见明显差异(P＞0.05);两组均于210日龄再次检测,两组抗体水平差异显著(P＜0.05).同时选择临床健康仔猪90头,随机分为3组(A组、B组和C组),三组仔猪均于30日龄分别免疫HuN4-F112株、TJM株及JXA-R株高致病性猪蓝耳病活疫苗,严格隔离饲养,免疫后30 d后采集血样,进行PPRSV抗体检测,结果表明三种毒株活疫苗对仔猪的免疫效果无明显差异(P＞0.05).     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因缺失标记疫苗ELISA鉴别诊断方法的建立

为了配合（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）基因标记疫苗株（rHN4-Δ25＋NP49株）的临床抗体鉴别诊断应用,本研究以标记疫苗中缺失的25个氨基酸多肽作为包被抗原,通过对ELISA反应条件的优化,确定抗原最适包被浓度为500 ng/孔,血清最佳稀释度为1：40,同时确定其阴阳性临界值S/P判定标准为0.15,批内和批间重复实验结果显示其变异系数均低于10%,表明该方法具有良好的重复性。对临床血清检测结果显示与IDEXX试剂盒检测结果的符合率为94.84%,采用25 aa负标记ELISA方法检测HuN4-F112免疫猪血清,结果显示从免疫后21 d可检测25 aa特异性抗体,该抗体至少可持续存在126 d。本研究建立的ELISA检测方法为今后PRRSV基因工程标记弱毒疫苗株在临床鉴别诊断的应用提供了有利保障。     

HuN4-F112株高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗免疫后病毒血症和抗体消长规律的试验报告

应用高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗(HuN4-F112株)对28~30日龄的仔猪进行免疫,并定期采样检测,研究免疫后病毒血症持续时间和抗体消长规律,结果表明,病毒血症在免疫后第1周即可出现,最长可持续至免疫后第6周;疫苗免疫后,母源抗体明显下降,免疫后第3周平均阻断率最低为18%,此后开始上升,至免疫后第7周平均阻断率达到最高值85%,随后开始缓慢下降,至免疫后第16周时为54%。研究表明,HuN4-F112株高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫后病毒血症持续时间最长为6周,抗体水平在免疫后第7周时达到最高。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒强/弱毒感染PAM细胞生物学特性比较分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)强、弱毒株在PAM细胞上的增殖特性,本研究在体外分离培养了健康猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),然后分别用高致病性PRRSV强毒HuN4株和弱毒疫苗HuN4-F112株感染PAM细胞,细胞病变观察和间接免疫荧光检测结果显示,二者在体外均可以感染PAM细胞,其中强毒HuN4株感染PAM细胞CPE较为明显。在两个毒株感染PAM细胞后12、24、36、48、60h分别收获病毒感染的细胞,利用抗PRRSV N蛋白单抗进行Western blot分析检测病毒核蛋白在不同时间表达量的变化,结果表明,强毒株在感染PAM细胞的早期,N蛋白合成表达量明显高于弱毒疫苗株,而弱毒疫苗株在感染Macr-145细胞早期,N蛋白的合成量则明显优于强毒株。比较HuN4株与HuN4-F112株在PAM细胞和Marc-145细胞的生长曲线,结果显示强、弱毒在PAM细胞和Marc-145细胞生长趋势存在明显差异,其中强毒HuN4株在PAM细胞上增殖能力明显强于弱毒株,而弱毒HuN4-F112株在Marc-145细胞上的增殖能力明显强于其在PAM细胞上的增殖能力,表明PRRSV强毒株对靶细胞PAM的感染能力较强,弱毒疫苗株对其感染能力相对较弱。本研究为深入了解PRRSV强毒株与弱毒疫苗株的致病性差异提供了理论依据。     

PRRSV GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后特异性抗体的中和活性分析

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后产生的特异性抗体的中和活性,研究以原核表达的重组蛋白GP5和M为抗原分别与霍乱毒素B亚基(CTB)佐剂按10∶1的比例混合制备成CTB黏膜佐剂疫苗,滴鼻免疫小鼠,于首次免疫后0,7,14,21,28,35,42 d收集唾液和血清样品,利用间接ELISA方法分别检测免疫小鼠唾液中特异性抗体IgA,结果均于28 d时S/N值达到最高,ELISA效价均为1∶2;血清中特异性抗体IgG分别于21,28 d时S/N值达到最高,ELISA效价均为1∶800。通过本实验室建立的基于PAM细胞中和试验方法分别检测唾液中特异性抗体IgA和血清中特异性抗体IgG中和滴度均1∶2,结果表明PRRSV GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后产生的特异性抗体未达到免疫保护作用的中和抗体水平。     

三种猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果评价

为研究不同猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗的的免疫特性,分别采用PRRSV变异株(JXA1-R)弱毒疫苗、经典PRRSV(VR 2332)弱毒疫苗、变异株(JXA1)灭活疫苗,免疫接种PRRSV抗原和抗体阴性的健康断奶仔猪,免疫接种后70d用PRRSV变异株强毒攻毒,ELISA检测血清中PRRSV特异的抗体水平及IFN-γ、IL 2、IL 4、IL 8、IL 10的水平,并进行临床症状和肺部病理组织学观察和评分。结果表明,VR 2332、JXA1-R弱毒疫苗对免疫猪攻毒保护效果差异不显著,均为63.6%(7/11),JXA1灭活疫苗免疫攻毒保护效果较差,为36.4%(4/11)。试验还发现病毒感染猪血清中细胞因子IFN-γ和IL-10的比值可以作为评价疫苗免疫效果的一个指标。     

不同毒力猪繁殖与呼吸综合征病毒对仔猪肺和外周免疫器官损伤的研究

为研究不同毒力的PRRSV对仔猪肺脏和外周免疫器官损伤的差异,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4株)和PRRSV经典株(CH-1a株)感染35日龄健康的断奶仔猪,并在感染后0 d、3 d、7 d、10 d和14 d各迫杀3头,检测肺、颌下淋巴结、肠系淋巴结、腹股沟淋巴结、扁桃体和脾脏的病毒载量及病理变化情况,同时检测血清中抗PRRSV的抗体水平。结果表明:感染后3 d肺脏及各免疫器官可检测到病毒,HuN4感染组病毒载量比CH-1a感染组病毒载量高1 000倍;HuN4感染组病毒载量峰值出现在感染后10 d,而CH-1a感染组维持着较低水平的病毒载量。组织病理学检测显示HuN4感染组淋巴结内淋巴细胞显著减少,呈空泡状;CH-1a感染组淋巴结内淋巴细胞轻度减少,呈星隙状。本实验表明HuN4株比CH-1a株对肺和外周免疫器官造成更严重的损伤。     

应用灭光定量RT-PCR方法检测PRRSV变异株在仔猪体内动态分布

为进一步了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(HuN4株)在体内的动态分布规律和特点,探讨病毒对组织器官的嗜性,本研究将HuN4株和细胞传代致弱毒株HuN4-F65人工感染40日龄健康仔猪,分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d和28 d各迫杀2头,并应用建立的荧光定量RT-PCR方法对脑、颌下淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和十二指肠等组织及血清中的PRRSV进行定量检测.结果显示:感染后HuN4组各器官病毒载量比HuN4-F65组高100倍,病毒栽量峰值期出现在感染后7 d,随后呈下降趋势.HuN4株在仔猪体内分布广泛,在21 d的试验期内持续存在,并且各器官的病毒载量呈正态分布规律;而HuN4-F65株血清病毒载量较低,并且集中在单核巨噬细胞相对密集的扁桃体和颌下淋巴结,与HuN4株主要嗜性器官肺脏相比发生了改变.     

不同CSF免疫状态下猪PRRS易感性及IFN-γ分泌细胞应答

采用酶联免疫斑点检测技术（ELISpot）检测自然状态下猪外周血单核细胞（PBMC）中分泌IFN-γ的细胞数,并用带T细胞表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）特异性小分子多肽刺激培养的PBMC,观察IFN-γ的分泌变化。结果显示,猪瘟病毒（Classical fever virus,CSFV）抗体阳性组中感染PRRSV比率小于CSFV抗体阴性组。CSFV抗体阳性猪PBMC中IFN-γ分泌细胞数量均高于CS—FV抗体阴性组,CSFV抗体阴性且受PRRSV感染猪的PBMC对PRRSV多肽刺激不应答。结果表明,对CSFV疫苗应答好的猪对PRRSV感染有一定的抵抗,其细胞免疫处于活动状态,提示2种传染病的免疫应答机理有部分相关性。     

猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗对PCV2与猪繁殖和呼吸综合征病毒共感染猪群免疫力评价

本试验旨在探讨猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗对PCV2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪生产性能及免疫保护力的影响。将287头仔猪随机分为2组,一组于出生后14 d和28 d免疫107.0TCID50PCV2疫苗各1 mL,另一组不予免疫。记录各组临床症状变化、断奶体重、保育后体重,并按时采血检测PCV2抗体。结果显示,在PCV2、PRRSV感染猪场,免疫组发病2头,死亡0头;对照组发病18头,死亡12头,免疫组发病率和死亡率明显低于对照组。二者在保育阶段增重变化差异显著(P<0.05),PCV2疫苗免疫后能够较快地产生保护力。     

应用荧光定量RT-PCR方法检测PRRSV变异株在仔猪体内动态分布

为进一步了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(HuN4株)在体内的动态分布规律和特点,探讨病毒对组织器官的嗜性,本研究将HuN4株和细胞传代致弱毒株HuN4-F65人工感染40日龄健康仔猪,分别于感染后1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d和28d各迫杀2头,并应用建立的荧光定量RT-PCR方法对脑、颌下淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和十二指肠等组织及血清中的PRRSV进行定量检测。结果显示:感染后HuN4组各器官病毒载量比HuN4-F65组高100倍,病毒载量峰值期出现在感染后7d,随后呈下降趋势。HuN4株在仔猪体内分布广泛,在21d的试验期内持续存在,并且各器官的病毒载量呈正态分布规律;而HuN4-F65株血清病毒载量较低,并且集中在单核巨噬细胞相对密集的扁桃体和颌下淋巴结,与HuN4株主要嗜性器官肺脏相比发生了改变。     

PRRSV强弱毒体外诱导IL-10产生差异的分子基础研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染后能够引发机体产生免疫抑制,IL-10在病毒介导的免疫抑制中起重要作用。PRRSV HuN4株感染PAM细胞后能够诱导IL-10高水平表达,而其传代致弱毒株HuN4-F112感染PAM细胞后IL-10表达水平很低。本研究以PRRSV HuN4株及HuN4-F112株为研究对象,对其感染PAM细胞后IL-10上游关键因子表达差异进行研究,揭示诱导IL-10产生差异的分子基础。结果显示,PRRSV强弱毒感染PAM细胞后,强毒HuN4株诱导TLR2与TLR4转录水平显著高于弱毒HuN4-F112株,TLR3、TLR7和TLR9转录水平则无显著差异;强毒HuN4株感染PAM细胞后,其p38磷酸化水平显著高于弱毒HuN4-F112株,而ERK磷酸化水平差异不具备显著统计学意义。结果提示,PRRSV强弱毒株感染PAM细胞诱导IL-10表达水平的差异推测是由于强弱毒诱导p38 MAPK磷酸化水平差异造成的。     

PCV2多表位靶向性疫苗仔猪免疫应答及疫苗免疫效力评价

制备猪圆环病毒2型(PCV2)多表位靶向性疫苗探讨其免疫应答类型及对仔猪免疫效力。用参考疫苗和PCV2多表位疫苗免疫21日龄PCV2和PRRSV抗原、抗体双阴性仔猪,流式细胞仪检测外周血T、B细胞含量和Th1/Th2比值,荧光定量RT-PCR检测IL-17、TGF-β及IFN-γ基因转录和ELISA测定IL-2、IL-4和IL-10蛋白表达,以期确定免疫应答类型。通过PCV2抗体效价和仔猪免疫攻毒保护试验评价疫苗免疫效力。结果显示,参考疫苗(A组)和PCV2多表位疫苗(B组)T细胞含量于免疫后7,14 d显著升高;Th1细胞在7～28 d显著升高,而Th2细胞含量无明显变化,使得Th1/Th2比值发生明显偏移,其中B组发生偏移程度较A组轻,表明疫苗免疫发生以Th1为主的T细胞免疫应答。A和B组IL-17和IFN-γ转录水平均显著升高,其中B组在7～14 d达到峰值,显著高于A组,显示B组细胞免疫活化和非特异性反应更强。外周血中IL-2蛋白含量A和B组均有所升高,组间差异不明显;IL-4蛋白含量A组在免疫后35 d明显高于B组,说明A组体液免疫强于B组。TGF-β基因转录水平和IL-10蛋白含量在免疫后无明显变化,显示均未导致免疫抑制的发生。A和B组疫苗均能刺激机体产生抗体,保护仔猪抵御PCV2强毒攻击,但B组疫苗免疫效力高于A组。结果表明,PCV2多表位靶向性疫苗主要刺激Th1介导的细胞免疫应答,激活IL-17和IFN-γ基因转录和IL-2、IL-4蛋白表达,有效保护免疫仔猪抵御PCV2强毒的攻击,具有良好的免疫保护效力。该研究为PCV2新型疫苗的研制和推广应用提供了技术和数据支撑。