不同野生稻居群DREB1B启动子的克隆与进化分析

根据Genbank所公布OsDREBIB的启动子序列设计引物,从12个不同普通野生稻居群和2个主要栽培稻亚种(籼、粳)克隆DREBIB启动子序列.结果表明,该启动子绝大部分区域都非常保守,存在1个AGC重复序列,若含有5个AGC重复,重复序列后第16个碱基为A,若含有6个或7个AGC重复,此位点碱基为T,并且在启动子中发现几个逆境相关的顺式作用元件.进化树分析表明,同一地域分布的居群存在相近的进化关系,但也受海拔等因素的影响.     

天然彩色棉纤维特异表达启动子LTP3的克隆及其在烟草中的表达特异性

报道天然彩色棉纤维特异表达启动子LTP3,大小为1 548 bp。经测序分析,与GenBank中登录的海岛棉（Gossypium hirutum L.DES119）特异表达启动子序列同源性为99%,仅有个别碱基发生改变,而启动子的基本元件未发生突变。将克隆的启动子与报告基因GUS融合,构建植物表达载体pBI-LTP3,...     

籼稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证

从籼稻（Oryzasativa L.ssp.indica）品种谷秆两用稻‘东南201’中克隆获得胚乳特异性启动子Gt1;序列全长为929 bp;含胚乳中特异表达所必需的正调控元件GCN4 motif（TGAGTCA）与Skn-1 motif（GT-CAT）等。与已报道的粳稻品种‘日本晴’的序列相比,籼稻‘东南201’Gt1启动子序列仅在-507 bp处发生一个碱基突变,在-268、-267、-194、-193 bp位置处分别缺失1个碱基;但在已知功能motif,两者没有任何差异。用Gt1替代35SCa MV启动子驱动GUS基因转化水稻‘台粳9号’,结果表明GUS基因仅在胚乳中特异表达,而在其它组织中未表达。克隆的籼稻谷蛋白基因Gt1的启动子序列,可为进一步开展水稻品质分子改良提供必要手段。     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至 7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含"GC"碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至+7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含“GC“碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

拟南芥rd29A启动子的克隆及植物表达载体构建

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA为材料,根据Gen Bank中拟南芥rd29A启动子序列设计引物,采用PCR克隆一段长度为951 bp的rd29A启动子序列。采用Plant CARE启动子在线预测工具分析表明,rd29A启动子序列具有TATA-box、CAAT-box基本的顺式作用元件和1个脱落酸应答元件(ABRE)和2个脱水应答调控元件(DRE)。将rd29A启动子序列亚克隆到pcambia3301载体的多克隆位点,构建了由rd29A启动子驱动的植物表达载体。     

大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子克隆与功能验证

【目的】克隆大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子（RIP2）序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据GenBank中已发表的RIP2序列（J00748．1）设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增RIP2序列,连接pMD18-T载体后用HindⅢ和BamH I进行双酶切,回收RIP2片段并连接至不含启动子的pEGFP-1载体上构建真核表达载体pEGFP-1-RIP2。重组质粒转染PK15细胞,24h后观察细胞荧光蛋白表达情况。【结果】克隆获得的RIP2序列与参考序列（J00748．1）的同源性为99．9％,存在3处碱基差异,即从起始密码子ATG（＋1）上游-57处有一个G碱基缺失,-387处C突变为A,-707处插入一个G碱基。RIP2序列存在一个TATA-box（-206～201位点）和一个CAAT-box（-343-339位点）。以重组质粒pEGFP-1-PIP2转染PK15细胞,24h后能观察到绿色荧光。【结论】克隆获得的大鼠RIP2序列具有启动子功能,但活性较CMV启动子弱。     

玉米醇溶蛋白基因Zein启动子克隆与序列分析

启动子是细胞内控制基因转录与表达的时空特异性的重要因子。玉米醇溶蛋白基因Zein启动子控制Zein基因在胚乳中特异性表达,分离Zein启动子将为外源基因在胚乳中特异性表达等遗传操作提供基础。以玉米自交系鲁2548基因组DNA为模版,PCR扩增得到401 bp的15 kuβ-Zein启动子,PCR产物T-A克隆并测序。序列分析结果显示,作者克隆的Zein启动子序列与NCBI已报道的15 ku-Zein基因(GenBank M72708)启动子序列同源性为96%。启动子功能预测及顺式元件分析表明,所克隆的启动子序列可能具有胚乳特异性启动子功能。有关功能验证试验正在开展之中。本研究为外源基因胚乳特异性表达基因工程奠定了基础。     

烟草雄蕊特异表达启动子TA29的克隆及序列分析

采用SDS法提取烟草(Nicotiana tabacum)叶片总DNA,根据GenBank中相关序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增获得一特异片段,并将其连接到pMD8-T载体上进行克隆测序.结果表明:该片段全长543 bp,与GenBank中报道的序列(AX012339)存在1个碱基的差异,同源性达99.8％;同时,采用生物软件对其进行序列分析,发现该片段含有启动子必备的核心元件:1个TATA-box、8个启动序列元件[PyPyAN (T/A) PyPy]以及1个CAAT-box、1个Cap site、1个I-box等元件,还存在与花粉特异性调控相关的AGAAA和GTGA等2个元件,推测该序列功能与雄蕊特异表达启动子TA29功能相同,从而为后期植物表达载体的构建及转基因奠定了基础.     

伪鹅观草高分子量麦谷蛋白基因启动子的克隆

通过PCR克隆的方法,从二倍体伪鹅观草St基因组中克隆到了高分子量麦谷蛋白亚基基因Glu-1St1的启动子,该序列全长959bp,序列比对及结构分析表明,它与麦类高分子量麦谷蛋白亚基基因的启动子序列的一致性很高,达到82%,包含有典型麦谷蛋白亚基基因启动子的顺式作用元件。系统进化分析表明,它与大麦的D-hordein基因启动子的进化关系比较近,属于典型的x型亚基基因的启动子。     

利用玉米作为生物反应器表达PEDV中和表位抗原蛋白

以玉米为生物反应器,将猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）主要中和抗原表位（core neutralizing epitope, COE）基因导入玉米自交系,获得了高效表达PEDV\|COE的转基因玉米稳定株系。首先,根据玉米密码子的偏好性,设计合成优化的COE编码基因,构建了植物表达载体pBAC9036。然后,利用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经过愈伤组织诱导、分化再生培养,获得71株转化再生植株,进而通过田间草甘膦抗性筛选,获得2个T1代转基因玉米稳定株系。通过PCR、RT\|PCR、间接ELISA和Western blot等鉴定结果显示,COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达。并且种子中COE蛋白占可溶性总蛋白的0.122％和0.078％。最后,提取转基因玉米稳定株系的种子可溶性蛋白,与佐剂混合皮下注射免疫小鼠并取可溶性蛋白灌胃免疫小鼠,均可产生针对PEDV抗原的特异性抗体。获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白,表达产物具有显著的免疫原性,为进一步研制PEDV\|COE转基因玉米疫苗奠定了基础。     

一株江苏新型鸭肝炎病毒的鉴定

对江苏地区分离到的1株疑似鸭肝炎病毒毒株（JS株）进行传代繁殖、雏鸭回归试验和理化性能测定,结果表明,该毒株能在鸭胚上进行传代繁殖,E1～E6代鸭胚毒的ELD50为10438·02 mL－1 ～10617·02 mL－1;攻毒的雏鸭可产生与I型鸭肝炎病毒相同的症状和病变;3,7,14日龄易感雏鸭的LD50分别为1055·02 mL－1,10517·02 mL－1,10383·02 mL－1;病毒对氯仿、乙醚和胰酶不敏感,对酸（pH 30）稳定,对热不稳定。进一步进行交叉中和试验、交叉被动保护试验和VP1基因序列分析,结果显示,该毒株的抗原性与经典1型DHV差异显著;VP1序列与多株1型DHV的同源性在693%～933%;从进化关系来看,与韩国株的亲缘性最近。JS株属于我国流行的新型鸭肝炎病毒（命名为N\|DHV\|JS株）。     

水稻WRKY转录因子OsWRKY71的cDNA分离和表达分析

WRKY蛋白是植物中最大的转录因子家族之一,对植物的生长发育具有重要调控作用。利用SMART\|RACE\|PCR技术分离获得水稻WRKY转录因子基因（OsWRKY71）的全长cDNA序列,并进行了相关的生物信息学分析。分离到的水稻WRKY转录因子cDNA全长为1 245 bp（GenBank登录号KJ137000）,开放阅读框1 047 bp,编码348个氨基酸,分子量为3828 kDa,OsWRKY71具有WRKY转录因子家族典型的保守结构域,属于第Ⅱ组WRKY蛋白家族。系统进化分析表明,OsWRKY71氨基酸序列与禾本科作物小麦的亲缘关系最近,其中与小麦序列相似性为69%,和大麦的序列相似性为68%。荧光定量PCR检测表明,OsWRKY71在孕穗期剑叶中表达丰度最高,根中最低,具有表达的空间差异性。抗病品种‘IR28’在受到稻曲菌诱导的初期,OsWRKY71基因表达呈现先升高后下降趋势,易感品种‘甬优9号’在受到稻曲菌诱导后表达受到抑制。这些结果表明,OsWRKY71的表达对稻曲菌侵染有应答响应,很可能在水稻防御稻曲菌侵染的机制中发挥作用。     

铃铛刺抗逆转录因子基因HhDREB2的克隆及分析

利用同源克隆和RACE(rapid amplification of cDNA end)技术从豆科铃铛刺属灌木铃铛刺中分离了一个DREB类转录因子基因的全长cDNA序列,命名为HhDREB2（Genbank No.:EU872018）。序列分析表明,该基因全长为873 bp,在108~626 bp处为开放阅读框,无内含子,编码172个氨基酸残基,分子质量为19.702 kDa,等电点8.92。系统进化树和同源序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白含有一个典型的AP2/ERF保守结构域,并与大豆GmDREB1和GmDREB2的亲缘关系较近,属于A5亚组。通过酵母单杂交试验,发现HhDREB2基因编码的蛋白具有转录激活的功能。此外,在洋葱表皮细胞中进行该基因的瞬时表达,证实了HhDREB2蛋白定位于细胞核。半定量RT\|PCR检测发现,HhDREB2基因受干旱、高盐和低温的诱导表达,而对GA3、NAA、ABA和6BA的处理无明显的变化。     

仿刺参过氧化氢酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

研究仿刺参（Apostichopus japonicus）免疫相关基因的功能和作用机制可为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。克隆了仿刺参过氧化氢酶（catalase）基因的全长cDNA序列,全长1 885 bp,其中5′\|非翻译区（5′\|untranslated region,UTR）长76 bp,3′\|UTR长306 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子量为56.56 kDa。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Catalase与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）和紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）的相似度最高,为75%。仿刺参catalase cDNA推导的氨基酸序列具有过氧化物酶定位信号PTS2、与还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 结合的氨基酸残基及与其它物种高度保守的Catalase近端血红素配体签名序列（351RLFSYSDTH359）。系统进化分析显示仿刺参处于无脊椎动物分支中,和紫海胆位于同一小支上。实时定量PCR结果显示,catalase mRNA在仿刺参肠、体壁、肌肉、呼吸树、体腔细胞和管足中均有表达,在肠中表达量最高。在细菌脂多糖LPS刺激后4 h,体腔细胞中catalase mRNA表达量显著升高,表明仿刺参的catalase基因在应对外来病原菌刺激的免疫应答中发挥了重要作用。     

乙草胺降解菌Sphingomonas sp. DC\|6的分离鉴定及其代谢途径的初步研究

从生产乙草胺的农药厂排污口污泥中分离到一株乙草胺降解菌,命名为DC\|6。根据形态特征、生理生化特性以及16S rDNA系统发育分析,初步鉴定其为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)。该菌能够降解甲草胺、乙草胺和丁草胺,而对于异丙甲草胺、丙草胺和异丙草胺却没有任何降解效果,48 h对丁草胺、乙草胺和甲草胺的降解率分别为76.7%、93.6%和98.6%,对甲草胺的降解效率最高,而对丁草胺的降解效率最低,表明侧链烷基长短影响着该类除草剂的降解速率,随着侧链基团碳原子的增加以及支链的增多降解效率呈下降的趋势。通过气相色谱-质谱鉴定了该菌降解乙草胺的代谢产物并分析了乙草胺的代谢途径,发现乙草胺首先N\|脱烷基形成2\|氯\|N\|(2\|乙基\|6\|甲基苯基)乙酰胺（CMEPA）,然后水解生成苯胺衍生物2\|乙基\|6\|甲基苯胺（MEA）,MEA能够进一步完全降解。但苯胺类化合物降解途径中的关键酶苯胺双加氧酶没有参与MEA降解代谢,表明菌株DC\|6对MEA的降解不同于已报道苯胺降解途径。     

产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达

用PCR技术,从一株田间分离的产气荚膜梭菌基因组中扩增出了1 194 bp的α毒素基因,经限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切处理后将其连接在经同样内切酶处理的载体pET\|28a(+)中的相应位点上,最后转化至受体菌BL21(DE3)中。经PCR、双酶切和核苷酸序列分析,证明重组质粒pET\|28a\|CPA含有产气荚膜梭菌α毒素基因,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的基因获得了良好表达。以羊抗α毒素多克隆血清进行Western blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应,表明目的蛋白具有较好的免疫原性。     

驽巴贝斯虫PCR检测方法的建立及应用

根据驽巴贝斯虫BC-48基因序列,设计并合成1对特异性引物,建立了驽巴贝斯虫PCR检测方法。试验扩增出610 bp的基因片段,其序列与GenBank上驽巴贝斯虫BC-48基因同源性为96.7%。而对新孢子虫、弓形虫、马巴贝斯虫的基因组DNA没有扩增带出现。对驽巴贝斯虫基因组DNA的最小检测量为2.812 fg/μL。通过对35份临床样品的检测,阳性率为20%。同时与血液涂片染色镜检进行了比较,结果表明,PCR检测方法准确、敏感、特异。     

鸡源坦布苏病毒（SN01株）的分离与鉴定

采用SPF鸡胚与vero细胞传代接种法,从江苏某蛋鸡场临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、全身多器官出血为主要特征的发病鸡肝脏、卵巢病料组织中分离一株病毒。该分离毒不能凝集鸡和鹅红细胞, 并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR结果排除了分离毒为禽流感病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒;用坦布苏病毒特异引物扩增为阳性, 序列测定与分析结果显示分离毒与GenBank上登录和实验室保存的坦布苏病毒E基因序列同源性在99%以上。上述结果表明分离毒（SN01）可能是一种新的坦布苏病毒,属于黄病毒科坦布苏病毒属,暂称为鸡源坦布苏病毒。     

新型番鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其抗原特性

新型番鸭呼肠孤病毒是近年来新发现的一种引起鸭严重疾病的病原,该病毒与经典MDRV主要在病毒宿主范围、体外培养特性、临床致病性和免疫保护特性上存在显著的差异。通过RT\|PCR扩增新型呼肠孤病毒σC基因,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理,插入到pET\|28a（+）原核表达载体,获得重组质粒pET\|28a（+）\|σC。将重组阳性质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达后经SDS\|PAGE电泳对σC蛋白进行初步分析,蛋白分子量约为36 kDa。重组蛋白经纯化后免疫实验兔,获得抗σC蛋白的高效免疫血清。通过Western Blot与间接免疫荧光实验初步表明,新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白具有良好的反应活性。