花药特异表达基因TaRAFTIN1a启动子的克隆及表达载体构建

组织特异性启动子是植物基因工程改良的重要工具。RAFTIN是禾本科植物花药绒毡层中特异积累与花药发育相关的蛋白,其调控序列可能提供一个很好来源的花药特异性表达启动子。为了解小麦TaRAFTIN1a基因启动子的花药表达特异性,本研究分离了TaRAFTIN1a基因的启动子,生物信息学分析表明,该启动子含有3种花药特异表达元件(总计10个),1个ABRE脱落酸响应元件,TGACG-motif与CGTCA-motif茉莉酸甲酯响应元件各1个,8个ARR1AT细胞分裂素响应元件,以及2个DRE和1个MBS干旱响应元件。采用5'端缺失的方法,分别克隆1429、898和351 bp的启动子片段,经连接、转化与鉴定,构建了3个含TaRAFTIN1a启动子不同区段融合GUS报告基因的植物表达载体,p WAER1,p WAER2,p WAER3,为通过转基因了解启动子的表达特征及其核心作用元件奠定了基础。     

矮牵牛花特异表达启动子PchsA的克隆及蓝色基因F3′5′H表达载体的构建

[目的]克隆花特异表达启动子PchsA,将此启动子与蓝色基因“F3′5′H”构建新的表达载体,拟以该启动子驱动“F3′5′H”在其他花色中特异表达。[方法]根据GenBank报道的矮牵牛启动子的序列设计并合成一对特异引物,以蓝紫色矮牵牛总DNA为模板,用PCR仪扩增目的片段。[结果]PCR扩增出的启动子DNA片段长约550bp,回收后连接到PGM-T质粒载体上,经转化、筛选确定重组子,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序,得到片段长度为553bp。经DNAMAN软件分析和GenBank上BLAST序列比对,显示序列与已报道序列同源性为98．55％。应用pcgene软件进行序列分析,结果表明试验克隆的启动子含有启动子所必须的所有调控元件,这与报道的序列基本一致。[结论]试验成功地克隆了CHSA启动子并将其与“F3′5′H”构建成能够在植物中进行道传转化的表达载体,为培育新型花色新品种奠定了基础。     

矮牵牛果实特异表达启动子FBP7的基因克隆及序列分析

为进一步实现外源基因在草莓果实中的特异表达,克隆了矮牵牛果实特异表达启动子FBP7。根据GenBank发表序列设计引物,以矮牵牛(Petunia hybrida)总DNA为模板,通过PCR扩增获得约500 bp的DNA片段,回收该片段并克隆至PUC18载体上,测序后将所得序列与原序列进行比对,其同源性为97%。为分析这些差异序列是否影响启动子功能,进行了启动子功能预测及顺式作用元件分析。结果表明,所克隆的启动子序列应具有启动子功能,且能实现果实特异表达,其序列分析差异可能是由于个体差异及多态性的影响,为草莓果实特异表达启动子的选择提供新思路。     

3种不同启动子构建ACC脱氨酶基因植物表达载体

从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)UW4菌株克隆出ACC脱氨酶(1-aminocyclopmpane-1-carboxylic acid deaminase)基因连接至pGEM-T vector上,并采用3种不同启动子(组成型表达启动子CaMV35S、花特异表达启动子CHSA及衰老特异表达启动子SAG12)分别构建ACC脱氨酶基因的植物表达载体,经PCR及酶切鉴定均已构建成功.为后期选择不同的花卉等植物材料遗传转化研究打下基础.     

植物HSP70反义基因工程雄性不育表达载体的构建及鉴定

[目的]为更好地研究HSP70热激蛋白基因与植物雄性不育的关系。用PCR方法克隆了水稻花药特异表达启动子Osg6B,将其与设计合成的HSP70反义片段连接,构建了由水稻花药特异表达启动子Osg6B驱动的HSP70反义表达载体,并进行了PCR和酶切鉴定。[结果]克隆的Osg6B启动子序列与所发表的序列同源性高达97%,启动子区域的顺式调控元件完整;构建的由水稻花药特异表达启动子Osg6B驱动的HPS70反义表达载体通过了菌落PCR验证和表达载体值粒的酶切鉴定,载体构建成功。[结论]该表达载体的构建将为植物基因工程雄性不育的利用奠定基础。     

籽粒高效特异性表达启动子的克隆与表达分析

启动子是调控基因表达的重要元件,本研究从燕麦中克隆了燕麦球蛋白基因的启动子序列,经过比对发现新克隆的启动子序列长960 bp,与参考序列AY795082存在9个SNPs。对启动子组成元件进行分析表明,该启动子含有胚乳特异表达所必须的5个Skn-1(GTCAT)基序;在启动子的正链第622 bp和830 bp处存在胚乳表达相关的顺式调控元件GCN4;在启动子的正链550 bp和负链869 bp处有两个O_2位点,曾在玉米中被验证为醇溶蛋白代谢顺式调控元件;在启动子的869 bp处有一个回文结构ACATGTCATCATGT,该序列是胚乳特异表达所必需的。除了上述与胚乳特异性表达有关的元件,该启动子序列中还有许多与逆境响应有关的序列元件。利用上述启动子驱动GUS基因表达试验证明,该启动子启动功能基因表达的强度约为参考序列的5倍,为利用转基因技术改良小麦籽粒性状提供了良好的基因表达驱动元件。     

高等植物绿色组织特异表达启动子研究进展

为实现目的基因的定点、定时表达,组织特异性启动子的开发和应用成为植物基因工程中的研究热点。绿色组织特异启动子驱动外源基因在茎叶等绿色组织中特异表达,并且启动子的组织特异性是由其上存在的正负调控元件相互作用而决定的。综述了绿色组织特异启动子的种类及调控元件,并对其在植物基因工程中的应用前景进行了展望。     

家蚕蛹期特异基表达因BmCP283鉴定及其启动子的克隆分析

【目的】鉴定家蚕蛹期特异基因及其启动子,为家蚕变态发育人为调节及蛹生物反应器开发提供支撑。【方法】基于芯片表达数据分析及RT-PCR验证,筛选家蚕蛹期特异表达基因;利用PCR方法克隆家蚕蛹期特异表达基因上游的启动子序列,并利用转基因技术验证启动子的活性及时期特异性。【结果】筛选获得了在家蚕蛹期特异表达的表皮蛋白基因BmCP283;所克隆的BmCP283上游启动子区序列长2 004 bp,利用此序列所构建以红色荧光蛋白基因dsRed为报告基因的转基因蚕中,BmCP283启动子驱动的dsRed只在蛹后期表达,且主要表达于翅等组织中。【结论】BmCP283为家蚕蛹期特异表达基因,克隆获得的BmCP283启动子的启动活性具有蛹期特异性。     

番茄根特异表达基因LeGRP2启动子的克隆及其在拟南芥的表达分析

目的克隆获得番茄根特异表达启动子,为利用基因工程技术创制番茄新种质奠定基础。方法利用Clontech公司的基因组步移(genome walking)技术,扩增番茄根特异表达基因LeGRP2的上游调控序列,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性。结果以番茄基因组DNA为模板,经过2次基因组步移,获得了LeGRP2基因上游1959bp的调控序列(GenBank登录号:EU262719),分析发现含有9个与根特异表达相关的顺式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1。转基因拟南芥的组织化学染色分析表明,GUS基因主要在拟南芥的根部特异表达。结论克隆获得了番茄LeGRP2基因启动子,该启动子主要在转基因拟南芥根部表达GUS基因,具有较强的根表达特异性。     

乳腺特异表达载体缺失片段的鉴定与修复

通过对pBC1中的乳腺特异表达启动子成分进行分析,鉴定了位于β酪蛋白启动子上游两个EcoRⅠ位点(-89~-94和-120~-125)之间的缺失片段,31bp的缺失使得该载体中的一个乳控盒元件(-112~-141)和一个乳腺因子识别序列(-92~-102)遭到破坏,并使得位于TATA框上游的所有启动子成分发生了位置改变。通过与山羊β酪蛋白启动子序列进行比较,设计并合成了缺失片段,经一系列的酶切和连接处理,使得该缺失得到了修复,修复后的载体具有所有乳蛋白表达需要的启动子调控原件。本试验结果为利用修复后的乳腺特异高效表达载体进行乳腺生物反应器的研究奠定了分子生物学基础。     

猕猴桃果实特异表达异戊烯基转移酶基因植物表达载体的构建

以pBI121质粒为载体,将猕猴桃素基因启动子与ipt编码基因连接,构建猕猴桃果实特异表达ipt嵌合基因。     

水稻胚乳特异表达启动子DXCP35的克隆及功能鉴定

根据水稻全生育期基因表达谱芯片数据库找到1个在水稻胚乳特异表达的基因,命名为DX35,用PCR技术从水稻品种明恢63基因组中克隆得到其上游1 356bp长度的启动子DXCP35。将DXCP35与β-glucuronidas(GUS)报告基因融合后,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化获得转基因水稻阳性植株,通过组织化学染色法证明DXCP35是1个胚乳特异表达启动子。对其进行5′端缺失分析,构建了6个缺失载体,通过验证缺失载体的表达谱,证明308bp长度的启动子就足以维持胚乳特异表达模式。     

家蚕中肠特异启动子BmAPN的克隆及活性分析

【目的】克隆和鉴定1个家蚕中肠特异启动子,为研究家蚕的免疫应答和应用研究提供新的工具。【方法】从家蚕品种大造中提取基因组总DNA,用PCR方法克隆家蚕中肠特异表达基因BmAPN（GenBank登录号：BAA33715.1）的上游调控序列。利用此序列构建以EGFP为报告基因的转基因表达载体pBac[BmAPN-EGFP-SV40,3×P3-DsRed],通过显微注射获得转基因家蚕,在个体水平上检测启动子的活性。【结果】所克隆的BmAPN启动子长度为1 598 bp,其驱动的EGFP仅在转基因家蚕中肠特异表达,与内源基因BmAPN的表达特征一致。该启动子在家蚕幼虫时期活性相对较高,且在起蚕期的活性要明显高于眠蚕期,推测该启动子中的特异元件受激素调控。【结论】经克隆获得的BmAPN启动子为有活性的启动子,且为家蚕中肠特异启动子。     

拟南芥中花特异表达启动子PCHS的分离及其功能初探

根据已发表的拟南芥启动子序列（AF248988）设计合成一对引物,以拟南芥（Arabidopsis）基因组DNA为模板,通过PCR技术获得了约含500bp大小的DNA片段,经纯化后测序得到531bp的目的片段。通过DNAman进行序列分析表明,与文献报道的PCHS启动子序列有99%的同源,含有4个花特异表达的调控元件。将此启动子替换pBI121上的CaMV35S启动子构建植物表达载体,农杆菌介导法浸染矮牵牛花、茎、叶、根。GUS瞬时表达结果表明,在花上出现较深的蓝色,而在茎上的蓝色很浅,在根和叶中不显蓝色,初步确定该启动子具有较强的花特异表达特性。     

猕猴桃果实特异表达ipt基因的构建

异戊烯基转移酶(ipt)基因是细胞分裂素生物合成关键酶．为保证／ipt基因仅在猕猴桃开花授粉之后的幼果期开始有效表达,作者以pUC119质粒为克隆载体,将猕猴桃果实特异表达的猕猴桃素(Actinidin)因启动子与ipt编码基因连接构建成猕猴桃果实特异表达ipt基因．     

GUS基因瞬时表达检测小麦1Ay基因启动子功能

本试验以pAyGUS为转化质粒,该质粒为小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因1Ay的启动子和β-葡糖苷酸酶(GUS)基因的重组质粒,利用基因枪法将该质粒导入小麦胚乳及胚中,检测其表达活性。通过X-gluc染色检测表明,GUS基因在该启动子的驱动下能在小麦种子中特异表达,可见小麦1Ay基因的启动子具有在小麦胚乳中特异表达的活性,这为小麦品种改良及转基因研究奠定了基础。     

PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪的构建

[目的]建立PIWIL1基因启动子调控的特异性表达Cre重组酶的转基因猪,为研究piRNA及其相关基因的功能和机制奠定基础。[方法]通过PCR扩增,从猪的全基因组上扩增出PIWIL1基因的启动子。切除猪源Cre重组酶的表达载体pET28a-MHC-Cre-BGHpo1yA-FRT2neor的启动子MHC,将其与PIWIL1基因启动子连接,构建成特异性表达Cre重组酶的pPIWIL1-Cre载体。将该载体转染小型猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选,获得阳性克隆进行核移植。[结果]获得2头PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre酶的转基因猪。[结论]成功构建了PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪,为研究piRNA及其相关基因的功能和机制提供了工具猪。     

陆地棉叶片特异性表达启动子的克隆与表达分析

【目的】本研究旨在获得叶片特异表达启动子的全长并进行表达分析,为抗逆转基因育种提供重要顺式作用元件。【方法】通过基因芯片及RT-PCR筛选鉴定出1个高活性的棉花叶片特异性表达基因,通过电子克隆及PCR获得了该基因全长,并通过染色体步移法(Genome walking)经过3次步移成功获得翻译起始位点上游2kb左右的DNA片段,将其命名为叶片特异性表达启动子LSP(leaf specific promoter)。【结果】生物信息学分析表明,该序列含有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box及多个顺势作用元件。通过构建该启动子驱动GUS的植物表达载体p Ghlsp∷GUS,并经农杆菌花絮侵染法转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色观察,结果显示该基因主要在叶片中特异性表达,而根部以及茎部几乎不表达。【结论】LSP是一个全新的叶片特异性表达启动子,为研究外源基因在棉花叶片中的定位表达奠定基础。基因工程中利用此类启动子可以在改良棉花性状的同时减少对棉花生理方面的副作用,在棉花抗逆转基因育种方面有广泛的应用前景。     

△6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物,以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板,通过PCR扩增,克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明,试验得到扩增片段长1148bp,含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接,构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR,为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。     

水稻种子特异表达基因OsEnS38的克隆与表达

以粳稻中花11为材料,利用生物信息学技术,结合RT–PCR,克隆了水稻OsEnS38的c DNA序列;其编码的蛋白序列包含2个Cupin_1保守结构域,属于典型的Bicupin亚家族。启动子分析发现,OsEnS38启动子区域含有多种与胚乳特异表达相关的顺式作用元件;q RT–PCR和原位杂交结果证实,OsEnS38在开花后7~14 d的种子中特异表达,在第10天的胚乳中表达量最高,达29.73;杂交信号在第7、10天的胚乳中高表达;共表达分析显示,共表达基因参与水稻胚后发育和生殖发育调控,表明该基因在种子发育和储藏物质积累过程中发挥作用。