水稻胚乳特异表达启动子DXCP35的克隆及功能鉴定

根据水稻全生育期基因表达谱芯片数据库找到1个在水稻胚乳特异表达的基因,命名为DX35,用PCR技术从水稻品种明恢63基因组中克隆得到其上游1 356bp长度的启动子DXCP35。将DXCP35与β-glucuronidas(GUS)报告基因融合后,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化获得转基因水稻阳性植株,通过组织化学染色法证明DXCP35是1个胚乳特异表达启动子。对其进行5′端缺失分析,构建了6个缺失载体,通过验证缺失载体的表达谱,证明308bp长度的启动子就足以维持胚乳特异表达模式。     

甘蓝型油菜种子特异表达油体蛋白启动子P_(BnOA03)的克隆及功能分析

为了改良油菜种子的性状,常常需要研究种子特异表达目的基因的情况。在分析油菜油体蛋白表达模式的基础上,选择种子特异高表达的油体蛋白,根据甘蓝型油菜基因组序列设计引物,利用PCR技术从基因组中克隆到一段715bp的启动子序列。启动子顺式元件分析表明,这一克隆序列具有CAAT-box和TATA-box启动子基本元件,另外含有ABA响应元件等多种顺式元件。进一步利用GUS报告基因在拟南芥中对该启动子的功能进行鉴定,结果表明,在转基因株系的幼苗、根、茎、叶、花和种子发育前期及成熟种子中没有检测到GUS基因明显表达,在种子发育的中后期检测到GUS基因的表达逐渐增强。说明这个启动子的表达调控具有一定的种子特异性。     

籽粒高效特异性表达启动子的克隆与表达分析

启动子是调控基因表达的重要元件,本研究从燕麦中克隆了燕麦球蛋白基因的启动子序列,经过比对发现新克隆的启动子序列长960 bp,与参考序列AY795082存在9个SNPs。对启动子组成元件进行分析表明,该启动子含有胚乳特异表达所必须的5个Skn-1(GTCAT)基序;在启动子的正链第622 bp和830 bp处存在胚乳表达相关的顺式调控元件GCN4;在启动子的正链550 bp和负链869 bp处有两个O_2位点,曾在玉米中被验证为醇溶蛋白代谢顺式调控元件;在启动子的869 bp处有一个回文结构ACATGTCATCATGT,该序列是胚乳特异表达所必需的。除了上述与胚乳特异性表达有关的元件,该启动子序列中还有许多与逆境响应有关的序列元件。利用上述启动子驱动GUS基因表达试验证明,该启动子启动功能基因表达的强度约为参考序列的5倍,为利用转基因技术改良小麦籽粒性状提供了良好的基因表达驱动元件。     

一个水稻CCCH型锌指蛋白基因的表达模式分析

利用RT-PCR、生物信息学及其启动区与GUS基因的融合表达分析等方法,分析了一个水稻CCCH型锌指基因OsZF77的表达模式。OsZF77开放阅读框包含843个核苷酸,编码280个氨基酸,含有2个CCCH锌指结构域。RT-PCR分析表明该基因在水稻种子的胚乳中具有较高丰度的表达而在胚中不表达。对OsZF77上游2．5kb左右的启动子区段进行分析发现含有种子特异性表达必需的序列元件RY（CATGCATG）。进一步分析了该基因启动子区段与GUS基因融合表达载体的转基因水稻植株,结果表明GUS在种子胚乳特别是靠种皮的外围胚乳中具强表达,而在胚中检测不到GUS活性。以上结果说明该基因是一个胚乳优势表达基因。     

植物HSP70反义基因工程雄性不育表达载体的构建及鉴定

[目的]为更好地研究HSP70热激蛋白基因与植物雄性不育的关系。用PCR方法克隆了水稻花药特异表达启动子Osg6B,将其与设计合成的HSP70反义片段连接,构建了由水稻花药特异表达启动子Osg6B驱动的HSP70反义表达载体,并进行了PCR和酶切鉴定。[结果]克隆的Osg6B启动子序列与所发表的序列同源性高达97%,启动子区域的顺式调控元件完整;构建的由水稻花药特异表达启动子Osg6B驱动的HPS70反义表达载体通过了菌落PCR验证和表达载体值粒的酶切鉴定,载体构建成功。[结论]该表达载体的构建将为植物基因工程雄性不育的利用奠定基础。     

玉米醇溶蛋白基因Zein启动子克隆与序列分析

启动子是细胞内控制基因转录与表达的时空特异性的重要因子。玉米醇溶蛋白基因Zein启动子控制Zein基因在胚乳中特异性表达,分离Zein启动子将为外源基因在胚乳中特异性表达等遗传操作提供基础。以玉米自交系鲁2548基因组DNA为模版,PCR扩增得到401 bp的15 kuβ-Zein启动子,PCR产物T-A克隆并测序。序列分析结果显示,作者克隆的Zein启动子序列与NCBI已报道的15 ku-Zein基因(GenBank M72708)启动子序列同源性为96%。启动子功能预测及顺式元件分析表明,所克隆的启动子序列可能具有胚乳特异性启动子功能。有关功能验证试验正在开展之中。本研究为外源基因胚乳特异性表达基因工程奠定了基础。     

籼稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证

从籼稻（Oryzasativa L.ssp.indica）品种谷秆两用稻‘东南201’中克隆获得胚乳特异性启动子Gt1;序列全长为929 bp;含胚乳中特异表达所必需的正调控元件GCN4 motif（TGAGTCA）与Skn-1 motif（GT-CAT）等。与已报道的粳稻品种‘日本晴’的序列相比,籼稻‘东南201’Gt1启动子序列仅在-507 bp处发生一个碱基突变,在-268、-267、-194、-193 bp位置处分别缺失1个碱基;但在已知功能motif,两者没有任何差异。用Gt1替代35SCa MV启动子驱动GUS基因转化水稻‘台粳9号’,结果表明GUS基因仅在胚乳中特异表达,而在其它组织中未表达。克隆的籼稻谷蛋白基因Gt1的启动子序列,可为进一步开展水稻品质分子改良提供必要手段。     

水稻叶绿体表达体系的建立及抗PPT叶绿体转化植株的获得

 【目的】建立外源基因在水稻叶绿体中的表达体系。【方法】通过分析已公布的水稻叶绿体基因组全序列及其基因分布特点，选择ndhF与trnL的基因间序列作为除草剂PPT抗性基因bar定点整合的位点。以水稻叶绿体基因组DNA为模板，采用PCR方法克隆了两个适于水稻叶绿体基因组遗传转化的同源片段，构建了含水稻叶绿体16S高效表达启动子、外源基因bar、psbA基因的3′序列（终止子）以及两个同源片段的水稻叶绿体特异表达载体pRB。【结果】采用基因枪法转化水稻品种中花10号幼穗诱导的愈伤组织，并再生植株，获得转化体后代种子。对转化植株进行的分子检测结果表明，外源基因bar 可能被整合到水稻叶绿体基因组中。后代种子的遗传学分析显示，外源基因bar可正常表达并遗传。【结论】利用所建立的水稻叶绿体外源基因表达体系，外源基因bar既可在水稻叶绿体基因组中正常表达，还可作为转化体筛选时的除草剂抗性选择标记。     

家蚕蛹期特异基表达因BmCP283鉴定及其启动子的克隆分析

【目的】鉴定家蚕蛹期特异基因及其启动子,为家蚕变态发育人为调节及蛹生物反应器开发提供支撑。【方法】基于芯片表达数据分析及RT-PCR验证,筛选家蚕蛹期特异表达基因;利用PCR方法克隆家蚕蛹期特异表达基因上游的启动子序列,并利用转基因技术验证启动子的活性及时期特异性。【结果】筛选获得了在家蚕蛹期特异表达的表皮蛋白基因BmCP283;所克隆的BmCP283上游启动子区序列长2 004 bp,利用此序列所构建以红色荧光蛋白基因dsRed为报告基因的转基因蚕中,BmCP283启动子驱动的dsRed只在蛹后期表达,且主要表达于翅等组织中。【结论】BmCP283为家蚕蛹期特异表达基因,克隆获得的BmCP283启动子的启动活性具有蛹期特异性。     

GUS基因瞬时表达检测小麦1Ay基因启动子功能

本试验以pAyGUS为转化质粒,该质粒为小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因1Ay的启动子和β-葡糖苷酸酶(GUS)基因的重组质粒,利用基因枪法将该质粒导入小麦胚乳及胚中,检测其表达活性。通过X-gluc染色检测表明,GUS基因在该启动子的驱动下能在小麦种子中特异表达,可见小麦1Ay基因的启动子具有在小麦胚乳中特异表达的活性,这为小麦品种改良及转基因研究奠定了基础。     

玉米sh2和bt2基因的克隆及胚乳特异表达载体的构建

采用Trizol剂试提取玉米胚乳总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码基因bt2和sh2,并克隆玉米胚乳特异表达的isa基因启动子,利用酶切连接方法,构建bt2和sh2基因的单子叶植物胚乳特异表达载体.结果表明,bt2和sh2基因正向插入胚乳特异的ISA启动子和T-nos终止子之间,成功构建p3301-ISA-bt2-T35S和p3301-ISA-sh2-T35S植物胚乳特异表达载体.     

水稻rbcS启动子的克隆及其在转基因水稻中的特异性表达

为将高效特异的启动子用于转基因水稻研究,利用PCR技术从水稻‘中花11’基因组DNA中克隆了rbcS启动子,序列分析表明,扩增片段(2 746 bp)与已报道的该基因序列相应区域的同源性达99.2%。将rbcS启动子与GUS报告基因融合构建了由rbcS启动子引导GUS基因的植物表达载体,经农杆菌介导法导入到水稻中。对转基因水稻植株中GU S活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片中的特异性表达,其表达水平高于C aMV 35S组成型启动子,而在转基因水稻植株根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织特异性。     

AtCS82基因T-DNA插入突变体筛选和过表达转基因植株的获得

AtCS82是拟南芥中一个功能未知的基因,推测该基因可能与种子油脂合成代谢相关。为探明AtCS82基因的功能,采用半定量RT–PCR法对AtCS82基因在拟南芥不同组织(茎、叶、花、果荚)中的表达情况进行了分析,发现其在果荚中的表达量较高,而在茎、叶、花中的表达量明显偏低,推测AtCS82基因可能参与种子发育;使用三引物法对T–DNA插入突变体进行纯合子筛选,并通过RT–PCR检测纯合子植株中AtCS82基因的表达情况,试验结果证明获得了稳定遗传的AtCS82基因沉默纯合突变体;通过构建pCAMBIA1300–35S::CS82过表达载体,并转化拟南芥哥伦比亚野生型(Col)的方式,获得了AtCS82基因的过表达转基因植株。     

矮牵牛果实特异表达启动子FBP7的基因克隆及序列分析

为进一步实现外源基因在草莓果实中的特异表达,克隆了矮牵牛果实特异表达启动子FBP7。根据GenBank发表序列设计引物,以矮牵牛(Petunia hybrida)总DNA为模板,通过PCR扩增获得约500 bp的DNA片段,回收该片段并克隆至PUC18载体上,测序后将所得序列与原序列进行比对,其同源性为97%。为分析这些差异序列是否影响启动子功能,进行了启动子功能预测及顺式作用元件分析。结果表明,所克隆的启动子序列应具有启动子功能,且能实现果实特异表达,其序列分析差异可能是由于个体差异及多态性的影响,为草莓果实特异表达启动子的选择提供新思路。     

拟南芥sscd1–1点突变对其表达的影响

为了探明拟南芥sscd1–1突变体中sscd1–1突变基因表达水平的降低是由剪切效率所致还是由自身启动子影响所致,分别构建了由外源35S启动子驱动的SSCD1正常基因和sscd1–1突变基因的表达载体及由内源自身启动子驱动的SSCD1正常基因和sscd1–1突变基因的表达载体,并将其转入到拟南芥sscd1–1突变体中。采用RT–PCR分析sscd1–1突变基因的表达。结果显示:外源35S启动子驱动的sscd1–1突变基因的表达与正常基因相比没有明显差别,而内源自身启动子驱动的sscd1–1突变基因的表达显著降低,这表明sscd1–1的点突变没有影响其剪切效率;sscd1–1突变基因表达水平的降低是由内源自身启动子影响所致。     

玉米种子特异启动子GBSS Ⅰ的克隆及其功能分析

玉米子粒被认为是生产外源蛋白的理想载体，而利用种子（胚乳）特异性启动子是提高外源蛋白表达水平最简单的途径。从玉米基因组中克隆获得长为999 bp的GBSSⅠ基因启动子pGBSSⅠ，该序列不但含有CAAT-box等启动子基本元件，而且还包含光响应、激素调控、胁迫诱导和发育等多个顺式调控元件。利用该启动子构建植物表达载体pCBG-Gus，并经农杆菌介导法转化玉米幼胚，通过筛选和分化获得抗性植株。经Bar蛋白基因金标免疫试纸条和PCR检测确认获得转基因阳性玉米植株。对转基因玉米不同组织中Gus和内源GBSSⅠ的转录情况进行实时定量PCR分析和Gus组织化学染色分析，结果表明：2个基因的表达水平并不一致。在转录水平上，除了叶片（包括叶鞘）之外，其他被检组织中的Gus的表达均低于GBSSⅠ；在蛋白表达水平上，除了茎和根之外，其他组织中均可检测到程度不同的Gus活性表达，其中成熟种子（包括胚和胚乳）中Gus蛋白积累的水平最高。综上，玉米子粒特异启动子pGBSSⅠ是一个具有潜在应用价值的启动子，将为提升玉米胚乳中外源蛋白的表达量提供理论依据。     

玉米淀粉分支酶sbe Ⅱ b基因启动子的克隆与特异表达

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

水稻花药特异表达基因RA8的启动子的分离和结构分析

根据文献设计一对引物 ,通过PCR的方法扩增了RA8是水稻花药特异表达基因的启动子。序列分析表明该启动子含有CAATbox的序列CAAT、TATAbox的序列TATAATA等表达调控元件 ,以及编码区的起始密码子ATG。     

2个水稻PLT基因启动子的克隆及其表达分析

为研究水稻中PLT基因的表达及功能,利用同源序列分析,在水稻基因数据库中检索到2个与拟南芥PLT基因高度同源的基因序列,命名为OsPLT7和OsPLT11。根据进一步预测的PLT启动子序列设计引物,以水稻品种中花11的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到PLT7、PLT11的启动子片段,克隆至含有报告基因的表达载体上并转化水稻。通过GUS染色观察T1代转基因阳性植株,发现OsPLT7和OsPLT11在水稻根部干细胞小生境和中柱部位表达,表达模式类似于其同源基因在拟南芥中的表达谱。     

玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子的克隆与特异表达（英文）

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。