环丙沙星诱导对临床耐药菌株主动外排基因转录的影响

笔者拟研究环丙沙星诱导对大肠埃希菌临床耐药菌株Y35、J45主动外排基因acrA、acrB、acrD、acrE、acrF、mdtA及外排调控基因marA、robA和soxS mRNA水平的影响。采用微量肉汤稀释法,测定环丙沙星对Y35、J45不同诱导阶段MIC;采用荧光定量PCR检测方法,对Y35、J45及二者诱导至10、20、30代菌株的主动外排及外排调控基因mRNA相对转录量进行测定。结果显示:经过30代诱导,环丙沙星对诱导株MIC均增至原来的2倍,达到256μg·mL~(-1)。Y35耐药株诱导至10和30代时,除了mdtA基因外,其他8个基因转录量介于1.20~96.07,与未诱导株相比差异显著(P0.05或P0.01),acrD基因转录量增加最为明显;至20代时,acrA、acrB、marA与10代诱导株相比,转录量下降,但高于原代菌株转录量;acrE、robA和soxS基因转录量数值介于1.40~3.81,与未诱导株相比差异显著(P0.05或P0.01)。J45耐药株至10代时,acrB、acrF基因转录量增加,转录量分别为原代菌株2.76和1.73倍,其他测定基因转录量下降;至20代时,acrA、acrB、acrE、mdtA基因转录量增加显著,分别为原代菌株的15.35、58.89、31.56、36.50倍,差异极显著(P0.01);至30代时,所有检测基因的转录量均大于原代菌株,acrF基因转录量增加最为明显,是原代菌株的102.54倍。本研究表明,长期使用环丙沙星诱导,能够使临床耐药株对其MIC值增加,耐药性增强;环丙沙星诱导能促使临床耐药菌株主动外排基因mRNA转录量增加,更强的耐药性可能是由主动外排泵介导产生。     

3种抗菌药物诱导改变marA、soxS和robA基因mRNA表达水平

本研究旨在探讨不同类抗菌药物诱导引起大肠肝菌主动外排系统调控基因marA、soxS、robA表达水平的变化特点.挑选大肠杆菌标准菌株O78经阿米卡星(AMK),环丙沙星(CIP),头孢曲松钠(CRO)逐代诱导的10、20、30代菌株作为试验菌株,提取其总RNA并反转录,采用荧光定量RT-PCR的方法测定其主动外排调控基因marA、soxS、robA的mRNA表达水平.结果表明:marA基因在CIP20中mRNA的表达水平最高,是母体菌株O78的2.30倍,且其在CIP10、CRO30、CIP30、AMK20的表达量分别为母体菌株O78表达量的2.11、1.71、1.15、1.44倍;soxS基因在AMK20中的表达量最高,是母体菌株的5.98倍,其它高于O78的菌株表达量的菌株为CRO30、CRO20、CIP20、CIP30;robA基因mRNA表达量除了在CIP10的表达量高于O78外,其余均低于母体菌株的表达.结果提示头孢曲松、环丙沙星、阿米卡星能诱导菌株的主动外排调控基因marA、soxS mRNA表达增加,robA基因mRNA表达减少.     

内江市猪源大肠埃希菌抗菌药与消毒剂交叉耐药性研究

为了解内江市猪源大肠埃希菌对抗菌药与消毒剂的交叉耐药情况及交叉耐药机制。本试验以大肠埃希菌标准菌株(ATCC 25922)为质控菌,检测从内江市分离的66株猪源大肠埃希菌的耐药性,采用微量肉汤稀释法测定常用抗菌药恩诺沙星、土霉素和消毒剂苯扎溴铵、戊二醛对受试菌株的最小抑菌浓度(MIC),进行耐药性检测,并筛选出对抗菌药和消毒剂均耐药的交叉耐药菌;PCR扩增标准菌株和交叉耐药菌的qacE△1、acrA、acrB和tolC基因,采用琼脂糖凝胶电泳检测基因携带和扩增情况,并对acrA、acrB和tolC基因进行测序,以标准菌株的acrA、acrB和tolC基因为参照,比对交叉耐药菌相应基因突变情况。结果显示,从内江市分离的66株猪源大肠埃希菌对恩诺沙星和土霉素完全耐药,对苯扎溴铵耐药的有3株,而所有菌株均对戊二醛敏感,即对抗菌药和消毒剂均耐药的交叉耐药菌有3株,编号分别为5、6、7号。在检测的3株交叉耐药菌中,仅6号菌检出qacE△1基因;基因序列比对结果显示,与标准菌株相比,交叉耐药菌的acrA、acrB和tolC基因碱基和氨基酸均有突变发生,碱基突变率最高的是7号菌的tolC基因(2.10%),突变率最低的是7号菌的acrA基因(0.97%);氨基酸突变率最高的为7号菌的acrB基因(2.39%),突变率最低的是tolC基因,且3株菌突变率相同(均为0.22%);3个基因有部分碱基或氨基酸有一致突变。所检测的内江市猪源大肠埃希菌对常用抗菌药恩诺沙星和土霉素耐药性严重,已有对抗菌药和消毒剂交叉耐药的菌株,且其交叉耐药的机制与外排泵AcrAB-TolC有相关性。     

内江市猪源大肠埃希菌抗菌药与消毒剂交叉耐药性研究

为了解内江市猪源大肠埃希菌对抗菌药与消毒剂的交叉耐药情况及交叉耐药机制。本试验以大肠埃希菌标准菌株(ATCC 25922)为质控菌,检测从内江市分离的66株猪源大肠埃希菌的耐药性,采用微量肉汤稀释法测定常用抗菌药恩诺沙星、土霉素和消毒剂苯扎溴铵、戊二醛对受试菌株的最小抑菌浓度(MIC),进行耐药性检测,并筛选出对抗菌药和消毒剂均耐药的交叉耐药菌;PCR扩增标准菌株和交叉耐药菌的qacE△1、acrA、acrB和tolC基因,采用琼脂糖凝胶电泳检测基因携带和扩增情况,并对acrA、acrB和tolC基因进行测序,以标准菌株的acrA、acrB和tolC基因为参照,比对交叉耐药菌相应基因突变情况。结果显示,从内江市分离的66株猪源大肠埃希菌对恩诺沙星和土霉素完全耐药,对苯扎溴铵耐药的有3株,而所有菌株均对戊二醛敏感,即对抗菌药和消毒剂均耐药的交叉耐药菌有3株,编号分别为5、6、7号。在检测的3株交叉耐药菌中,仅6号菌检出qacE△1基因;基因序列比对结果显示,与标准菌株相比,交叉耐药菌的acrA、acrB和tolC基因碱基和氨基酸均有突变发生,碱基突变率最高的是7号菌的tolC基因(2.10%),突变率最低的是7号菌的acrA基因(0.97%);氨基酸突变率最高的为7号菌的acrB基因(2.39%),突变率最低的是tolC基因,且3株菌突变率相同(均为0.22%);3个基因有部分碱基或氨基酸有一致突变。所检测的内江市猪源大肠埃希菌对常用抗菌药恩诺沙星和土霉素耐药性严重,已有对抗菌药和消毒剂交叉耐药的菌株,且其交叉耐药的机制与外排泵AcrAB-TolC有相关性。     

MarA和SoxS共同调节大肠杆菌K12外排泵AcrAB-TolC的表达

利用Red同源重组技术构建大肠杆菌K12调控基因缺失菌株,探讨耐药发展过程中marRAB和soxRS对大肠杆菌K12外排泵AcrAB-TolC表达的调控作用。在环丙沙星浓度递增的条件下诱导K12及调控基因缺失菌株,分别获得系列突变菌株,测定各菌株对其他药物的MIC,并检测靶位基因突变情况。利用RT-PCR方法检测诱导突变株中外排泵基因、调控基因、膜孔蛋白基因的表达水平。结果表明,K12正向调控基因(marA和soxS)缺失株在环丙沙星选择压力下仅获得环丙沙星敏感性降低的菌株,而负向调控基因(marR和soxR)在环丙沙星选择压力下可获得环丙沙星中介和耐药的菌株,且诱导突变株仅出现与耐药有关的gyrA单突变(Ser83Leu和Asp87His)。正向调控基因marA和soxS缺失后,外排泵基因表达水平变化不明显,而负向调控基因marR和soxR缺失后,marA和soxS的表达水平显著升高,引起外排泵基因表达水平显著升高,最高达到约13倍。当阻遏蛋白SoxR被敲除后,soxS的表达水平没有变化,而marA的表达水平显著升高,外排泵基因acrB表达水平也升高,说明在调控AcrAB-TolC外排泵基因表达方面,marRA与soxRS存在功能上的冗余,即当其中一个调控因子功能缺陷时,另一个调控因子可以发挥互补调控功能。因此,MarA和SoxS对三聚体系统AcrAB-TolC的正向调控作用是通过解除负向调控蛋白MarR和SoxR对其的阻遏作用实现的,MarRA和SoxRS共同调节外排泵AcrAB-TolC的表达水平。     

不同耐药水平大肠杆菌acrA和marA基因转录水平的比较

为检测不同耐药水平大肠杆菌的acrA和marA基因转录水平，阐明t耐药大肠杆菌株药物敏感性变化与acrA和marA的mRNA水平之间的关系。用定量RT—PCR的方法比较多重耐药菌株SEMR、单药耐药菌株SEICI和SEICH以及质控株ATCC25922的acrA和marA的mRNA水平。结果表明，acrAmRNA水平，SEMR均是SEICI、SEICH和ATcC25922的16倍；marA mRNA水平，SEMR是SEICH的4倍、SEICl和ATCC25922的8倍；SEICI和SEICH的acrA mRNA和marA mRNA水平与ATCC25922无明显差异；同一菌株acrA mRNA和marA mRNA水平的变化保持了较为稳定的一致性。因此认为，大肠杆菌多重耐药菌株SEMR的acrA mRNA和marA mRNA水平与其耐药水平存在相关性。     

安妥沙星体外诱导大肠埃希菌耐药研究

为了探讨耐药外排泵AcrAB-TolC在大肠埃希菌对安妥沙星的诱导耐药中的发生机制,试验采用微量肉汤稀释法测定安妥沙星对大肠埃希菌标准菌株(ATCC25922)的最小抑菌浓度(MIC),以1/2 MIC为起点采用浓度递增法对ATCC25922进行体外诱导,并将诱导后的细菌在不含药的培养基上传代培养5次,每次传代后测定MIC值,以获得稳定耐药的菌株。并检测安妥沙星诱导前后大肠埃希菌株外排泵AcrAB-TolC基因序列的突变和mRNA表达量的变化。结果表明,诱导后的耐药菌株acrA有8处、acrB有40处、tolC有27处发生了碱基突变,其中acrB和tolC所编码的氨基酸序列也发生了改变,并且诱导后的菌株耐药外排泵AcrAB-TolC的基因acrA、acrB、acrZ、tolC的mRNA表达量极显著增加。     

大肠杆菌耐药菌的体外诱导及主动外排基因acrA表达量的变化

为探讨大肠杆菌的体外诱导及主动外排基因acrA表达量的变化,首先对选定大肠杆菌进行耐药性培养,得到各大肠杆菌的0,5,10,15,20,25及30代菌,测定MIC的变化,结果表明不同菌株的不同代数的主动外排基因acrA表达量均有变化。随着耐药性增加,大肠杆菌的主动外排基因acrA表达量也有所增加。以上结果表明大肠杆菌的耐药性与主动外排基因acrA的表达量有相关性。     

黄芩苷对耐药大肠杆菌marA基因mRNA表达水平的影响

为探究黄芩苷对耐药大肠杆菌主动外排调控基因marA的mRNA表达水平的影响,利用微量肉汤稀释法确定黄芩苷增敏环丙沙星的最佳浓度,然后对8株耐药菌株采取不加任何药物、单独加32mg/L黄芩苷或4 mg/L环丙沙星、32mg/L黄芩苷和4mg/L环丙沙星联合及16mg/L CCCP和4mg/L环丙沙星联合等5种方式培养,抽提总RNA并反转录成cDNA,荧光定量PCR测定主动外排调控基因marA及管家基因gapA的Ct值,并计算不同培养条件下各个耐药大肠杆菌marA基因mRNA相对表达量。结果显示,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数R~2=1.00,溶解曲线特异,marA基因产物Tm值为81.8~82.1℃;黄芩苷与环丙沙星联合培养的耐药菌外排泵基因marA表达量与环丙沙星单独培养相比明显下降,前者0.71~2.06,后者2.27~7.28;以上结果表明黄芩苷可以通过抑制外排泵调控基因marA发挥作用,提示其也许可作为大肠杆菌的外排泵抑制剂应用于临床。     

不同耐药水平大肠杆菌acrA和marA基因转录水平的比较

为阐明大肠杆菌耐药菌株药物敏感性变化与acrA和marA的mRNA水平之间的关系。用定量RT—PCR方法比较了多重耐药菌株、单药耐药菌株以及质控株ATCC25922的actA和marA的mRNA水平。结果。actA mRNA水平。多重耐药菌株SEMR是单药耐药菌株SEICI、SEICH和质控株ATCC25922的16倍；／natA mRNA水平。SEMR是SEICH的4倍、SEICI和ATCC25922的8倍；SEICI和SEICH的actA mRNA、marA mRNA水平与ATCC25922的无明显差异；同一菌株actA mRNA和marA mRNA水平的变化保持了较为稳定的一致性。结论：大肠杆菌多重耐药菌株的actA mRNA和marA mRNA水平与其耐药水平存在相关性。     

青岛市兔源产ESBL大肠杆菌的耐药性及多重耐药调控基因SoxS序列的分析

[目的] 了解兔源产ESBL大肠杆菌耐药特点,为掌握其造成的耐药性危害提供数据参考。[方法] 2015年3-4月从青岛4个养兔场采集118份兔粪便棉拭子,进行大肠杆菌分离,并检测对16种抗生素的耐药谱,及对多重耐药调控基因SoxS携带率。[结果] 从118份兔粪便棉拭子分离获得68株大肠杆菌,确证筛选出47株产ESBL大肠杆菌,占兔源大肠杆菌的69.1%。药敏结果显示所有产ESBL大肠杆菌菌株耐药性较强且呈现多重耐药,仅对碳青霉烯类药物敏感率100%。兔源产ESBL大肠杆菌多重耐药调控基SoxS携带率为100%,且不同动物源性产ESBL大肠杆菌的多重耐药调控基因同源关系较近。[结论]青岛地区兔源产ESBL 大肠杆菌分离率高且耐药谱广,多重耐药调控基因SoxS携带率高,主要涉及到细菌主动外排泵出机制,使得大肠杆菌对抗生素的敏感性中起到了至关重要的作用,本研究对抗生素在临床中的应用起指导意义。     

大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析

为检测大肠杆菌在某抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系.分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养,测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化;对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测定.四环素诱导株产生重耐药,氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药;四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致.四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因突变,诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致.     

大肠杆菌acrR插入序列对acrAB表达水平及多重耐药性的影响

为研究大肠杆菌(E.coli)分离株ED28的acrR基因中777bp插入片段对外排泵AcrAB表达水平及多重耐药性的影响,本研究将野生型acrR通过互补实验导入ED28中得到C-ED28。通过药物的最低抑菌浓度(MIC)测定、有机溶剂耐受性试验和实时定量PCR(qPCR)等方法检测菌株中AcrAB外排泵的活性。通过PCR方法检测ED28和C-ED28喹诺酮耐药决定区(QRDR)的氨基酸突变及携带的质粒介导喹诺酮类耐药(PMQR)基因和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因。结果显示,临床分离菌株ED28对12种抗生素呈多重耐药表型,而互补菌株C-ED28恢复了对多种药物的敏感性。当能量抑制剂(CCCP)存在时,喹诺酮类和β-内酰胺类药物对ED28的MIC普遍降低,而对C-ED28的MIC保持不变。ED28对染料溴化乙锭(EB)的MIC为512μg/mL,对正己烷和环己烷耐受;而C-ED28对染料EB的敏感性增强,MIC为16μg/mL,对正己烷耐受,对环己烷不耐受。qPCR结果显示,基因acrA和acrB在C-ED28中的表达水平低于亲本菌株ED28,而基因marA在C-ED28中的表达水平高于ED28。靶位突变检测和耐药基因检测结果显示,ED28存在gyrA(Ser83Leu和Asp87Asn)和parC(Ser80Ile)双突变,携带aac(6’)-Ib-cr、blaCTX-M-27和blaTEM-13个质粒编码耐药基因;而C-ED28仅存在gyrA(Asp87Asn)一个突变位点,并丢失aac(6’)-Ib-cr、blaTEM-1两个基因。     

DHPLC对环丙沙星诱导沙门菌靶基因和调控基因的突变筛选

选择11株动物源沙门菌(包括6种血清型)进行环丙沙星耐药性体外诱导.应用变性高效液相色谱(DH-PLC)对11株诱导株不同诱导阶段的靶基因gyrA、gyrB、parC、parE的喹诺酮耐药决定区(QRDR)和mar操纵子基因marO、marR、marA、marB、soxR、soxS及外排泵acrAB的抑制基因acrR(包括启动子区)进行基因突变筛选,并对筛选出的突变基因进行测序确证.结果显示,6种血清型沙门菌在诱导过程中,GyrA突变集中在S83F和/或D87G,marR、soxR、acrR均出现新突变,提示在环丙沙星诱导压力下,因靶基因和调控基因突变使耐药性不断增加.     

临床分离食品动物源多重耐药大肠杆菌耐药分子特征研究

本研究从主动外排机制、膜孔蛋白缺失及氟喹诺酮类药物作用靶位改变等几个方面探讨,临床分离的20株动物源性多重耐药大肠杆菌的耐药分子特征。实验结果表明,20株临床分离大肠杆菌gyrA83、gyrA87、parC80的突变率分别为95％、85％、55％。gyrA和parC共同突变的有11株,突变率为55％;20株多重耐药菌大肠杆菌普遍存在主动外排机制,主要介导对部分氨基糖苷类、四环素、氟苯尼考和氟喹诺酮类药物耐药,当添加外排泵抑制剂PAβN后多数菌株庆大霉素、新霉素、四环素、氟苯尼考及氟喹诺酮类药物的MIC都降低了2倍～256倍。利用建立的ELISA方法检测外排泵AcrA蛋白的表达水平,结果证实所有,临床分离菌外排泵表达都增高;20株分离大肠杆菌中,部分菌株缺失OmpC或OmpF蛋白,同时缺失这两个蛋白的只有3株。部分菌株OmpF蛋白条带附近存在有多重耐药相关蛋白（Mar）。本研究结果揭示多重耐药大肠杆菌对常用抗菌药物高水平的耐药表型是主动外排机制、药物作用靶位的改变、外膜通透性的改变及其它机制共同作用的结果。     

黄芩苷和沉默基因acrA、marA和acrD对耐药大肠埃希菌环丙沙星敏感性的影响

为探讨反义寡核苷酸(ASODN)沉默acrA、marA和acrD基因前后,黄芩苷对临床耐药大肠埃希菌(E.coli)环丙沙星敏感性的影响,设计并合成3个基因的ASODN引物,设置空白对照组、黄芩苷组、ASODN沉默组、ASODN沉默+黄芩苷组,分别转染到临床耐药菌感受态细胞中,涂布于一定浓度环丙沙星平板上,培养观察菌落生长情况并计数。结果发现,相对于空白对照组,黄芩苷组菌落数显著降低;acrA、acrD和marA基因沉默组与空白对照组相比,除了acrD基因沉默1号菌株和marA基因沉默的Y17菌株外,其余菌株在环丙沙星平板上的菌落数也出现不同程度地下降,具有显著性差异;acrA、acrD和marA基因沉默+黄芩苷组与黄芩苷组相比,多数菌株在环丙沙星平板上的菌落数均出现不同程度地下降;acrA基因沉默+黄芩苷组与acrA基因沉默组相比,4株菌株变化差异不显著,Y17号菌株菌落数有所上升,J45号菌株在该基因沉默后,环丙沙星平板上的菌落数出现下降的趋势,差异显著;acrD基因沉默+黄芩苷组与acrD基因沉默组相比,除了1号菌株变化差异不显著外,其余5株菌株变化差异显著,但Y17号菌株菌落数上升;marA基因沉默+黄芩苷组与marA基因沉默组相比,除了Y17、Y35这2株菌株变化差异显著外,其余4株菌株变化差异不显著。以上结果表明,黄芩苷主要通过抑制acrA和marA发挥外排抑制作用,acrD不是其增强环丙沙星敏感性的主要靶点。     

一株致猪肺炎大肠杆菌的分离鉴定及其耐药表型、耐药基因型分析

为了了解猪肠外致病性大肠杆菌的耐药性,试验采用菌落形态观察、小鼠毒力试验、回归动物试验和PCR等方法对1株引起猪肺炎的病原菌进行鉴定,并通过微量稀释法进行耐药性检测,在全基因组测序的基础上对耐药基因型进行分析。结果表明:该病原菌是肠外致病性大肠杆菌,呈多重耐药,其染色体基因组携带有外排调控基因Mar C、SoxR,外排泵基因MATE和ABC,耐药基因移动原件IS,四环素耐药基因tet,氟苯尼考耐药基因FloR及氯霉素乙酰转移酶基因等。     

鸡源多重耐药沙门菌转座子与耐药基因的研究

为了解鸡源性沙门菌分离株多重耐药情况与转座子及耐药基因的携带关系,采用K-B纸片法对23株鸡源性沙门菌分离菌株进行10种抗菌药物敏感试验;应用PCR对分离菌株进行转座子及耐药基因检测。结果显示,23株分离株中有10株对2种以上抗菌药物耐药,属于多重耐药株,其中四环素-氨苄西林-甲氧苄啶-诺氟沙星-庆大霉素-环丙沙星是主要多重耐药谱;10株多重耐药菌中有8株分别携带不同种的转座子(tnpA、tn1721、tnp513、IS26),其中以转座子tnpA、tn1721和IS26的检出率最高,耐药基因中以blatem-1、tetA和tetB的检出率最高,携带转座子多的菌株中耐药基因检出率较高且耐药谱广。结果表明沙门菌多重耐药性与转座子的携带之间关系密切,耐药表型与耐药基因检测结果基本一致。     

志贺菌耐药性研究进展

概述了致病性志贺菌的分类,对家畜及人类造成的危害,临床多重耐药性严重状况。从分子生物学角度介绍了志贺菌主要耐药性acrAB-tolC主动外排系统的作用特点及耐药性相关药物外输蛋白marA、acrA、acrB,基因hdeA、tolB、tol A、tol Q等研究进展,并阐述了克服志贺菌耐药性的对策。     

猪源多重耐药大肠杆菌Ⅰ型整合子的检测

为分析猪源多重耐药大肠杆菌中Ⅰ型整合子的流行情况,应用PCR方法检测其Ⅰ型整合酶基因(intⅠ)。结果表明:58.6%(34/58)猪源多重耐药大肠杆菌菌株为Ⅰ型整合酶阳性,表明猪源大肠杆菌的多重耐药性与整合子携带高度一致。