不同耐药水平大肠杆菌acrA和marA基因转录水平的比较

为阐明大肠杆菌耐药菌株药物敏感性变化与acrA和marA的mRNA水平之间的关系。用定量RT—PCR方法比较了多重耐药菌株、单药耐药菌株以及质控株ATCC25922的actA和marA的mRNA水平。结果。actA mRNA水平。多重耐药菌株SEMR是单药耐药菌株SEICI、SEICH和质控株ATCC25922的16倍；／natA mRNA水平。SEMR是SEICH的4倍、SEICI和ATCC25922的8倍；SEICI和SEICH的actA mRNA、marA mRNA水平与ATCC25922的无明显差异；同一菌株actA mRNA和marA mRNA水平的变化保持了较为稳定的一致性。结论：大肠杆菌多重耐药菌株的actA mRNA和marA mRNA水平与其耐药水平存在相关性。     

大肠杆菌acrA基因的克隆、表达、抗体制备及不同耐药水平大肠杆菌AcrA表达水平的检测

检测不同耐药水平大肠杆菌AcrA表达水平，探讨耐药水平与AcrA蛋白表达水平之间的关系。对acrA基因进行克隆、表达、制备抗AcrA抗体，Western blot方法比较同耐药水平大肠杆菌AcrA表达水平。结果表明，多重耐药株SEMR的AcrA表达明显高于单药耐药株SEICI和SEICH以及质控株ATCC25922。因此SEMR多重耐药性的产生与AcrA的高效表达直接有关。     

大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析

为检测大肠杆菌在某抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系.分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养,测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化;对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测定.四环素诱导株产生重耐药,氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药;四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致.四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因突变,诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致.     

AcrAB-TolC主动外排系统与猪源耐药大肠杆菌多重耐药的相关性

以前期获得的25株猪源耐药大肠杆菌为试验菌株,采用药敏纸片法测定以上分离菌株对氟苯尼考、多西环素、庆大霉素等11种药物的敏感性,并分析其多重耐药表型;采用PCR方法和实时荧光定量PCR方法分别检测25株猪源大肠杆菌中AcrAB-TolC主动外排基因的携带率以及不同耐药数量的多重耐药菌株的外排泵基因arA和acrB的表达量,同时分析其主动外排调控基因marA、soxS、robA和acrR相对表达量的差异,从mRNA水平上探讨外排泵基因表达量和调控因子与大肠杆菌多重耐药性的相关性。结果显示,25株耐药大肠杆菌中acrA、acrB和tolC等3种主动外排基因的携带率分别为68.00%、72.00%和76.00%;acrA、acrB这2种主动外排基因以及调控基因marA和soxS的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈正相关,调控基因acrR的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈负相关;robA调控基因的表达量均低于标准菌株,且与耐药谱数无明显相关性。结果表明,猪源耐药大肠杆菌携带acrA、acrB、tolC等3种基因主动外排基因的携带率较高,且与多重耐药菌株的耐药谱具有相关性;调控因子的表达量亦与多重耐药的耐药谱具有相关性。     

氨基糖苷类耐药鸭大肠杆菌acrD基因mRNA表达水平

从89株临床分离鸭源大肠杆菌中选择5株氨基糖苷类高水平耐药菌,应用实时荧光定量RT-PCR方法测定其主动外排基因acrD mRNA水平,选用1株中介株、1株敏感株和大肠杆菌ATCC25922作为对照,分析其mRNA转录水平与耐药强度的相关性。结果显示,5株耐药菌的acrD mRNA相对表达量均高于中介株和敏感株,其相对表达量分别是2.00、1.96、2.22、1.84、4.39,敏感对照株为1.67,中介对照株为1.75,除4号菌株外,其余4株耐药菌相对表达量和标准菌株ATCC25922具有显著性差异;同是高度耐药的4号菌和5号菌存在较大差异,5号菌相对表达量是4号菌的2.39倍,这说明对氨基糖苷类不同耐药程度的菌株acrD基因的转录、表达存在差异,且与耐药水平呈正相关,但同时存在其他重要耐药机制介导氨基糖苷类耐药。     

大肠杆菌多重耐药调节基区AcrR和MarR突变

研究大肠杆菌多重耐药外输泵抑制基因AcrR和MarR突变对大肠杆菌多重耐药的调节机制。采用琼脂平板二倍稀释法测定环丙沙星、诺氟沙星、氯霉素、四环素、利福平、庆大霉素、大观霉素、阿米卡星、链霉素、阿莫西林等10种药物对临床分离的33株大肠杆菌和大肠埃希氏菌的标准菌株ATCC25922的最小抑菌浓度（MIC），从中筛选出7株多重耐药菌和2株相对敏感菌，并对这9株菌及标准菌ATCC25922的AcrR和MarR基因进行聚合酶链式反应（PCR）扩增并克隆后测序，分析DNA序列及氨基酸序列的突变情况。耐药菌和敏感菌均发现有部分菌株发生了不同程度的点突变。AcrR和MarR同时突变将更大限度的提高细菌的耐药性。     

大肠杆菌多重耐药调节基因AcrR和MarR突变

研究大肠杆菌多重耐药外输泵抑制基因AcrR和MarR突变对大肠杆菌多重耐药的调节机制。采用琼脂平板二倍稀释法测定环丙沙星、诺氟沙星、氯霉素、四环素、利福平、庆大霉素、大观霉素、阿米卡星、链霉素、阿莫西林等10种药物对临床分离的33株大肠杆菌和大肠埃希氏菌的标准菌株ATCC25922的最小抑菌浓度(MIC),从中筛选出7株多重耐药菌和2株相对敏感菌,并对这9株菌及标准菌ATCC25922的AcrR和MarR基因进行聚合酶链式反应(PCR)扩增并克隆后测序,分析DNA序列及氨基酸序列的突变情况。耐药菌和敏感菌均发现有部分菌株发生了不同程度的点突变。AcrR和MarR同时突变将更大限度的提高细菌的耐药性。     

安妥沙星体外诱导大肠埃希菌耐药研究

为了探讨耐药外排泵AcrAB-TolC在大肠埃希菌对安妥沙星的诱导耐药中的发生机制,试验采用微量肉汤稀释法测定安妥沙星对大肠埃希菌标准菌株(ATCC25922)的最小抑菌浓度(MIC),以1/2 MIC为起点采用浓度递增法对ATCC25922进行体外诱导,并将诱导后的细菌在不含药的培养基上传代培养5次,每次传代后测定MIC值,以获得稳定耐药的菌株。并检测安妥沙星诱导前后大肠埃希菌株外排泵AcrAB-TolC基因序列的突变和mRNA表达量的变化。结果表明,诱导后的耐药菌株acrA有8处、acrB有40处、tolC有27处发生了碱基突变,其中acrB和tolC所编码的氨基酸序列也发生了改变,并且诱导后的菌株耐药外排泵AcrAB-TolC的基因acrA、acrB、acrZ、tolC的mRNA表达量极显著增加。     

实时荧光定量PCR检测多重耐药大肠杆菌AcrA基因mRNA表达水平

体外单一药物诱导标准大肠杆菌ATCC25922,获得了耐氯霉素（CHL,MIC≥256 mg/L）、耐环丙沙星（CIP,MIC≥256 mg/L）、耐水杨酸钠（SAL,MIC≥275 mg/L）、耐四环素（T,MIC≥512 mg/L）的菌株。选取ATCC25922株,4株中度耐药菌SAL（175）、CHL（64）、T（64）、CIP（128）,4株高度耐药菌SAL（275）、CHL（256）、T（512）、CIP（256）,和临床分离的3株耐药大肠杆菌H1、H9、H10,通过实时荧光定量RT-PCR方法检测外输泵AcrA基因的mRNA表达水平。系统自动分析软件显示,Ct值与标准质粒浓度的对数之间存在良好的线性关系,回归系数为0.992。检测结果表明：H10、CHL（256）、CIP（256）拷贝数最高,达1015拷贝/μL;T（512）、H9、T（128）、SAL（275）、H1为1014拷贝/μL;CHL（128）、T（64）、CHL（64）为1013拷贝/μL;ATCC25922为1012拷贝/μL。不同程度耐药株AcrA基因的表达量不同,临床分离株和诱导的各高耐药菌株均比ATCC25922株表达量高,且差异极显著（P≤0.01）。这说明不同耐药程度的11株菌cDNA的量存在差异,AcrA基因转录水平与耐药水平成正相关。     

黄芩苷和沉默基因acrA、marA和acrD对耐药大肠埃希菌环丙沙星敏感性的影响

为探讨反义寡核苷酸(ASODN)沉默acrA、marA和acrD基因前后,黄芩苷对临床耐药大肠埃希菌(E.coli)环丙沙星敏感性的影响,设计并合成3个基因的ASODN引物,设置空白对照组、黄芩苷组、ASODN沉默组、ASODN沉默+黄芩苷组,分别转染到临床耐药菌感受态细胞中,涂布于一定浓度环丙沙星平板上,培养观察菌落生长情况并计数。结果发现,相对于空白对照组,黄芩苷组菌落数显著降低;acrA、acrD和marA基因沉默组与空白对照组相比,除了acrD基因沉默1号菌株和marA基因沉默的Y17菌株外,其余菌株在环丙沙星平板上的菌落数也出现不同程度地下降,具有显著性差异;acrA、acrD和marA基因沉默+黄芩苷组与黄芩苷组相比,多数菌株在环丙沙星平板上的菌落数均出现不同程度地下降;acrA基因沉默+黄芩苷组与acrA基因沉默组相比,4株菌株变化差异不显著,Y17号菌株菌落数有所上升,J45号菌株在该基因沉默后,环丙沙星平板上的菌落数出现下降的趋势,差异显著;acrD基因沉默+黄芩苷组与acrD基因沉默组相比,除了1号菌株变化差异不显著外,其余5株菌株变化差异显著,但Y17号菌株菌落数上升;marA基因沉默+黄芩苷组与marA基因沉默组相比,除了Y17、Y35这2株菌株变化差异显著外,其余4株菌株变化差异不显著。以上结果表明,黄芩苷主要通过抑制acrA和marA发挥外排抑制作用,acrD不是其增强环丙沙星敏感性的主要靶点。     

苯扎溴铵和氯已定诱导的大肠埃希菌耐药性分析

为探讨细菌对消毒剂和抗菌药物耐药性之间的相关性,本试验通过亚抑菌浓度苯扎溴铵和氯已定分别对大肠埃希菌质控菌ATCC25922进行体外诱导培养,测定诱导前后多种抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)的变化,并通过实时荧光定量PCR检测诱导前后大肠埃希菌外排泵acrAB-Tolc中融合蛋白AcrA调控基因acrA mRNA的表达量;结果显示,经苯扎溴铵和氯已定诱导后的大肠埃希菌,对恩诺沙星、磺胺二甲嘧啶钠、土霉素、阿莫西林均产生了耐药性,且诱导后的菌株均存在acrA基因mRNA高水平表达,提示大肠埃希菌对消毒剂与抗菌药物之间的耐药性存在相关性,其机制可能是外排耐药机制。     

加减三黄汤对耐药大肠杆菌acrA mRNA表达水平的影响

为了解加减三黄汤对大肠杆菌耐药性的影响,采用实时荧光定量方法检测了外输泵acrA mRNA表达水平的变化。将100只昆明系小鼠分为阳性组(感染耐药性大肠杆菌2 751株和2 952株),阴性组,攻毒治疗组(2 751株+加减三黄汤,2 952株+加减三黄汤),8d后将鼠随机剖杀,取肝组织抹片培养大肠杆菌,做药敏试验,同时提取质粒,检测大肠杆菌外输泵基因acrA的mRNA表达量。结果显示,经加减三黄汤在体治疗后的大肠杆菌耐药性下降了,每μL中mRNA拷贝数为2 751株最高达1016,2 952株1015;用药后各菌株均有下降;相差极显著(P≤0.01),耐药性越大的拷贝数越多。表明加减三黄汤对耐药大肠杆菌外输泵基因acrA的mRNA表达水平影响与耐药性有一定的相关性。     

Comparison of Agar Dilution and E-test for antimicrobial susceptibility testing of Campylobacter coli isolates recovered from 80 Ontario swine farms

The primary aim of this study was to evaluate the level of agreement of the E-test for in vitro antimicrobial susceptibility testing of Campylobacter coli using the agar dilution technique, which is the approved method. A convenience sample of 80 Ontario swine farms was chosen for this study; each farm was visited from January to June 2004. A total of 233 isolates of C. coli were tested for susceptibility to 10 antimicrobials by agar dilution and the E-test. Performance of the tests was evaluated using 7 quality control strains: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Campylobacter jejuni ATCC 33560, and Campylobacter coli ATCC 33559 for the E-test and E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, and C. jejuni ATCC 33560 for the agar dilution test. Weighted Cohen's kappa and prevalence-adjusted bias-adjusted kappa (PABAK) tests were used for statistical analysis. The E-test and agar dilution test results had a strong agreement when resistance to streptomycin and tetracycline were evaluated (weighted kappa: 0.68 and 0.66, respectively). However, marked disagreement was detected when testing susceptibility to nalidixic acid and ampicillin (0.15 and 0.22, respectively). Almost perfect agreement was detected by PABAK when testing susceptibility to gentamicin (0.99). Agreement was found to be moderate for ciprofloxacin, azithromycin, clindamycin, erythromycin, and chloramphenicol. Although the level of agreement between the E-test and agar dilution depended on the antimicrobial being tested, the E-test always detected a lower proportion of resistant isolates compared to agar dilution.     

志贺菌耐药性研究进展

概述了致病性志贺菌的分类,对家畜及人类造成的危害,临床多重耐药性严重状况。从分子生物学角度介绍了志贺菌主要耐药性acrAB-tolC主动外排系统的作用特点及耐药性相关药物外输蛋白marA、acrA、acrB,基因hdeA、tolB、tol A、tol Q等研究进展,并阐述了克服志贺菌耐药性的对策。     

不同动物源性大肠杆菌多重耐药调控基因rob的同源性分析

为研究大肠杆菌多重耐药调控基因rob与不同动物源性及多重耐药水平之间的关系，选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌5株及大肠杆菌药敏质控株ATCC25922，在对其进行主要治疗药物耐药性检测的基础上，分别以其染色体DNA为模板，通过PCR反应扩增出大肠杆菌多重耐药调控基因rob，将该基因分别与克隆载体pMD18-T连接，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，对经酶切与PCR反应鉴定为阳性的克隆质粒进行了核苷酸序列测定。测序结果表明：不同动物源性大肠杆菌的rob基因与Gen-Bank中该基因的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列的同源性较高。不同源性大肠杆菌的rob基因的核苷酸序列与其动物源性有关，该基因的核苷酸序列的个别突变位点可能影响AcrAB外输泵的表达水平，进而影响其多重耐药水平。     

乳酸杆菌对病原菌粘附肉鸡肠粘液的影响

研究嗜酸乳杆菌、禽大肠杆菌O78、大肠杆菌ATCC 25922、鸡白痢沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌与肉鸡不同肠段粘液糖蛋白的粘附性能,探讨嗜酸乳杆菌对四种病原菌的粘附排斥作用.结果表明,在不同的肠道部位,嗜酸乳杆菌、鸡白痢沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌与肠粘液糖蛋白的粘附能力不同,而禽大肠杆菌O78、大肠杆菌ATCC 25922在各肠段粘液上的粘附性能相近;在相同的肠道部位,所试菌与肠粘液糖蛋白的粘附能力有差异,其中嗜酸乳杆菌的粘附作用最强;嗜酸乳杆菌对所试病原菌均有不同程度的粘附排斥作用,其中对鸡白痢沙门氏菌的粘附排斥较强,而对大肠杆菌ATCC25922的则较弱.     

五种抗生素联合应用对大肠杆菌抗菌效果

研究亚胺培南与头孢曲松钠、亚胺培南与头孢噻肟钠、丁胺卡那与痢菌净在体外联合应用对于大肠杆菌ATCC25922的抗菌效果。测定各种药物对于大肠杆菌ATCC25922的最小抑菌浓度,应用棋盘微量稀释法测定亚胺培南与头孢曲松钠、亚胺培南与头孢噻肟钠、丁胺卡那与痢菌净对大肠杆菌ATCC25922的抑菌效果。结果显示,亚胺培南与头孢曲松钠、亚胺培南与头孢噻肟钠、丁胺卡那与痢菌净联合应用对大肠杆菌ATCC25922呈现协同作用。亚胺培南与头孢曲松钠、亚胺培南与头孢噻肟钠、丁胺卡那与痢菌净的联合应用大大减少了药物用量,提高了药物效果,为临床用药提供理论支持。