根肿病菌核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用

 应用真菌核糖体基因ITS区段通用引物ITS1和ITS4,对十字花科蔬菜根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）rDNA进行PCR扩增,并将扩增到的目的片段克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行测序和碱基编码结构特点分析,结果表明:十字花科蔬菜根肿病菌ITS1区长141 bp,5.8 S区长160 bp,ITS2区长187 bp,rDNA总长为488 bp. 根据此序列设计一对根肿病菌特异性寡聚核苷酸引物（前引物:5’AGG TGA ACC TGC GGA AGG AT 3’和后引物:5’TTC AGC GGG TAA TCC TAC CT 3’）,应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术,对分离自十字花科蔬菜（白菜、青菜、甘蓝、芥蓝、花椰菜等）根肿病菌全基因组DNA进行特异性扩增试验。试验结果表明,该对引物能从十字花科根肿病菌全基因组DNA中扩增到约500 bp长度的分子片段,而对照菌株和健康对照则无扩增产物。该实验结果对有效追踪根肿病菌在田间的发生动态监测和预测预报提供了重要的信息和手段。     

十字花科蔬菜根肿病菌的PCR快速检测

利用设计合成的根肿病菌 (Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ)特异性寡聚核苷酸引物Ｄ85 81 9Ｆｗ/Ｄ85 81 9Ｒｖ,根据本研究组成员对十字花科蔬菜根肿病菌核糖体基因ＩＴＳ区段克隆测序结果 (未发表 )而设计的引物ＩＴＳＦｗ/ＩＴＳＲｖ和真菌核糖体基因ＩＴＳ区段通用引物ＩＴＳ1 /ＩＴＳ4,对分离自十字花科作物(白菜、青菜、甘蓝、芥蓝、花椰菜等 )根肿病菌全基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ(ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ)特异性扩增试验。试验结果表明 ,这 3对引物均能从十字花科根肿病菌全基因组ＤＮＡ中扩增…     

云南马铃薯青枯病菌的PCR检测

利用针对马铃薯青枯病菌hrp基因族DNA序列设计合成特异性寡核苷酸引物（引物1：5‘GAAGAGGAACGACGGAAAGC-3‘和引物2：5‘CGAACAGCCCACAGACAAGA-3‘）,进行马铃薯青枯病菌PCR特异性扩增试验。该试验合成的引物能从马铃薯青枯病菌总基因组的DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增青枯病菌hrp基因区段1993bp的分子片段。该试验结果为马铃薯青枯病菌的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术的方法。     

云南马铃薯青枯病菌的PCR检测

利用针对马铃薯青枯病菌 hrp 基因族DNA序列设计合成特异性寡核苷酸引物(引物1:5'GAAGAGGAACGACGGAAAGC-3'和引物2:5'CGAACAGCCCACAGACAAGA-3'),进行马铃薯青枯病菌PCR特异性扩增试验.该试验合成的引物能从马铃薯青枯病菌总基因组DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增青枯病菌 hrp 基因区段1993 bp 的分子片段.该试验结果为马铃薯青枯病菌的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术和方法.     

三七病原根结线虫的分子鉴定

利用设计合成的1对北方根结线虫（Meloidogyne hapla）特异性寡聚核苷酸引物Mh-F／Mh-R,以北方根结线虫、南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫全基因组DNA为对照,对采自云南文山、砚山、马关、蒙自等地区的三七根结线虫全基因组DNA进行PCR特异性扩增。结果表明,设计合成的引物能从北方根结线虫和供试的4个三七病原根结线虫全基因组DNA中扩增到462bp长度的分子片段,而南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫的全基因组DNA无扩增产物。表明4个地区的三七病原根结线虫种群均为北方根结线虫,该对引物可用于三七根结线虫的分子鉴定。     

土壤根肿病菌休眠孢子PCR快速检测方法的建立

根据GenBank中根肿病菌的保守序列,设计了一对引物,该引物能从供试的根肿病菌根组织中特异性扩增出一条498bp的预期条带。采用改良土壤DNA提取方法对人工配制病土中根肿病菌休眠孢子DNA提取,通过检测不同稀释度和不同孢子量的DNA检测结果证明,该检测方法能检测出土壤根肿病菌含量大于104个孢子/g孢子浓度的带菌土壤,且该方法具有快速、准确、简便、有效的特点。     

江西省十字花科作物根肿病影响因子研究

[目的]近年来,根肿病在江西省呈现快速蔓延和加重发生的态势,危害蔬菜产业发展安全.研究十字花科作物根肿病影响因子,掌握病害发生的基本规律,有助于科学制定区域性根肿病治理对策.[方法]采用威廉士鉴别系统鉴定病原菌生理小种,研究病菌致病性分化对根肿病的影响.设置根肿病田间病圃,分期播种小白菜,分析气象因素对根肿病的影响.设计作物轮作试验并结合田间调查,探明轮作对根肿病的防控效果.通过田间与人工接种试验,研究混播对病情的影响.[结果]江西省根肿病菌小种种群增多,鉴定出1号、3号、4号、5号、8号、9号、12号、16号共8个生理小种,以9号为优势小种.不同小种对不同十字花科作物致病力表现差异,9号小种对甘蓝、油菜不致病,对大白菜、小白菜、紫菜薹等致病;4号小种对多数十字花科作物致病,但对萝卜致病力较弱.高温会影响病情严重度,低温则不利于根肿病发生,适宜根肿病发生的月平均气温在24℃左右.降雨量对根肿病情的影响无规律性变化,但适温条件下强降雨加重病情.与水稻、西瓜、玉米等进行短期轮作来调控根肿病毫无效果,多年甚至数十年水稻田改种小白菜依然能发生根肿病.病原菌为9号小种时,小白菜病情单播重于与油菜混播,油菜单播与混播均未发病;病原菌为4号小种时,小白菜、油菜单播与混播,各自根肿病均较重发生,病情未因播种方式改变而变化.[结论]江西省根肿病菌小种种群增多,不同小种对不同十字花科作物致病力表现差异.高温会影响病情严重度,低温则不利于根肿病发生.降雨量对根肿病情的影响无规律性变化,适温条件下强降雨加重病情.轮作对根肿病的控制效果十分有限.在特定条件下抗性不同的十字花科属种间作物混播似存在化感现象.     

贵州省十字花科根肿病病原菌形态鉴定

<正>十字花科根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)引起的侵染性病害。植株感病时,根部形成手指状或块状的畸形膨大。基于此,针对贵州省部分地区所采集的十字花科不同作物根肿病样本,通过形态观察法与地衣红染色法,分别对油菜、甘蓝、白菜3种作物的病原菌进行观察、讨论及分析。研究结果显示,油菜、甘蓝、白菜这3种作物的根肿病病原休眠孢子在形态和大小上存在一定的差异,以期该研究结果为该病菌的生物学研究及生理小种研究提供一定的参考。十字花科根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)侵染引发的病害。芸薹根肿菌属于根肿     

苹果黑星病菌的分子检测

【目的】建立苹果黑星病菌(Venturia inaequalis(Cooke)Wint)的分子检测方法,以提高检测精确度,缩短检测时间。【方法】根据苹果黑星病菌与其他苹果病原真菌核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列间的差异,设计了1对特异性引物320A/320B,用于苹果黑星病菌的分子检测,对特异性引物扩增条件进行了优化,并验证和检验了引物的特异性和灵敏度。【结果】特异性引物的扩增条带约为320bp,优化的反应体系为:2μL MgCl2(25mmol/L),2.5μL 10×buffer,3μL dNTP(2.5mmol/L),1.2 μL引物320A/320B(10μmol/L),0.5μL聚合酶(5U/μL),1μL模版DNA(30ng/μL),加ddH2O至总体积25μL;反应程序为:94℃3min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min。利用该对特异性引物对包括苹果黑星病菌在内的26个苹果病原菌菌株基因组DNA进行的PCR扩增表明,只有苹果黑星病菌能扩增到1条约320bp的特异性条带,其他菌株及阴性对照的扩增产物均未检测到特异性条带。对接种苹果黑星病菌的苹果组织的检测表明,该对引物能特异性地检测到苹果黑星病菌的存在,其对苹果黑星病菌基因组DNA检测的灵敏度为100fp/μL。【结论】利用设计的特异性引物320A/320B,参考正交试验优化的体系和程序,结合简单的SDS法提取苹果黑星病菌基因组DNA,在1个工作日内即可完成对该病原菌的分子检测。     

巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

十字花科蔬菜品种对根肿菌4号和9号小种的抗性

依据江西省内根肿病菌的生理小种类群分布,分别在婺源县4号小种区域和南昌县9号小种区域设立田间病圃,于2016年9—12月对108个十字花科蔬菜(花椰菜、包菜、萝卜、大白菜、小白菜)品种进行抗性鉴定,并随机选取其中29个品种进行人工接种鉴定。结果表明:十字花科不同种间蔬菜对根肿菌不同小种的抗性存在差异,种内品种对同一小种的抗性也存在差异;花椰菜、包菜和萝卜对9号小种均有抗性,上海黑叶五月慢、新奶白、京绿乌塌菜3个小白菜品种和京夏王、北京桔红心、京春娃2号等13个大白菜品种对9号小种有抗性;参试品种对4号小种的抗性不如对9号小种的,但仍筛选到紧花6、紧花16、松花2等10个花椰菜品种和满堂红萝卜品种可在4号小种区域种植。     

长沙地区大白菜根肿病发生规律研究

长沙地区8月中.下旬播种的大白菜于9月上、中旬开始出现根肿病.10月中旬至11月初盛发.其侵染来源主要为土壤带菌、寄主作物除大白菜外,尚有小白菜、红菜苔、排菜、包菜、花菜、萝卜、等,大白菜以苗期易感此病.一般稻田改菜田、连作田以及播种早、土壤pH值低,秋季高温多雨等均可加重发病.     

青花菜病程相关蛋白基因 BoPR2 的克隆与表达

病程相关蛋白基因以家族形式存在于植物中,在抗病反应中起着重要作用。以青花菜为试材,利用PCR法克隆到1个PR2基因,定名为BoPR2。测序结果表明,BoPR2基因组全长1188bp,具1个内含子,编码区全长1092bp,编码351个氨基酸;序列比对和系统发育分析结果显示,BoPR2与野甘蓝、甘蓝型油菜和白菜PR2的相似度最高,在发育树上聚为一组,与亚麻荠、荠菜的相似度最低,亲缘关系最远;实时定量PCR结果表明,BoPR2的表达受芸薹根肿菌诱导,在10d时的相对表达量最大,约为对照的6倍;但BoPR2的表达不受核盘菌的诱导。BoPR2基因的克隆与表达分析,为青花菜抗病机理研究及开展分子育种奠定了基础。     

6-BA对大白菜根肿病发病率的影响

[目的]研究细胞分裂素与大白菜根肿病的关系,探讨大白菜根肿病的发病机理。[方法]从发病植株的肿瘤提取孢子,再提取孢子DNA进行PCR检测。将鉴定出的根肿菌孢子于播种期、发芽期以及发芽后21 d接种到三角瓶内的培养土中,于发芽期在培养土中添加0.08μmol/L 6-BA。从接菌植株长出的肿瘤提取孢子,对孢子进行电镜检验,并统计6-BA处理及对照的根肿病发病率。[结果]在三角瓶内,根肿菌可引起大白菜植株发病;添加0.08μmol/L 6-BA处理的根肿病发病率为100%,未加细胞分裂素处理的发病率为57%,前者肿瘤体积也明显大于后者。扫描电镜显示大白菜根肿菌休眠孢子的大小为1.5～4.3μm。[结论]6-BA能明显促进大白菜根肿病肿瘤的形成。     

"夏光"、"早夏16"甘蓝杂交种DNA指纹图谱的构建

用SDS法提取甘蓝(Brassica oleraceavar.capitata)杂交种“夏光”、“早夏16”及其各自亲本的基因组DNA,通过SSR、RAPD两种分子标记方法构建其DNA指纹图谱用于纯度鉴定。利用30对甘蓝SSR引物和50个适用于甘蓝的RAPD引物,以各杂交种及其亲本的基因组DNA为模板组合进行筛选,结果显示:多数SSR引物对两组合扩增带型一致,未能建立SSR指纹图谱;通过RAPD标记方法筛选出能鉴定两杂交种纯度的引物分别为S15、S42、S147和S42、S78、S88,其中引物S42对两组合均能扩增出特异的RAPD指纹图谱,并将RAPD指纹图谱转变为相应的数字指纹。     

不结球白菜S位点受体激酶基因片段的克隆与表达分析

以不结球白菜自交不亲和系03的基因组DNA和柱头cDNA为模板,利用引物SRKF/SRKR扩增获得长度为964 bp和646 bp的SRK基因片段。序列比较分析表明,克隆的基因片段属于SRK基因的激酶域,该序列包含4个外显子和3个内含子,编码215个氨基酸,与芜菁、甘蓝、芥蓝等SRK基因有90%以上的相似性。荧光定量PCR分析结果表明:自交不亲和系03和自交亲和系105不同组织中SRK基因的表达水平存在显著的差异,SRK基因主要在自交不亲和系的柱头中高度表达,自交亲和系中该基因的表达主要分布于叶片、花蕾和柱头组织中。     

羽衣甘蓝自交不亲和系的选育及S_(13b)单倍型的鉴定

该文采用亲和指数法(种子数/自交授粉花朵数)分别在羽衣甘蓝‘赤兔’和‘白波’栽培品种的自交后代中,经过3年的自交选育获得1个自交不亲和系4·1·1和一个自交亲和系3·2·3·由于在芸苔属植物F1代杂交种的生产和自交不亲和分子机制的研究方面S单倍型鉴定是必要的,因此在该文中我们采用了PCR方法利用引物PK1和PK4获得了BoSRKx的基因组序列,此序列的大小为919bp.经过数据库检索比对后发现BoSRKx的序列与BoSRK13b的序列完全一致.通过反转录PCR的方法获得了BoSRKx的cDNA序列,结果发现BoSRKx和BoSRK13b的序列在转录水平上也是完全一致的;另一方面,我们采用SCR保守信号肽编码区和NotⅠ-oligo(dT)设计的引物获得了BoSCRx的cDNA序列,经过数据库的检索比对后发现BoSCRx的序列比BoSCR13的序列只多出3个连续的碱基.根据上述结果我们推断出Sx单倍型就是S13b单倍型;最后,通过遗传分析结合PCR-RFLP方法和DNAblot方法对自交不亲和系进行了S13b纯合体的鉴定.     

油菜根肿病在湖北省的发生分布及其引起的油菜产量损失评估(英文)

[目的]明确油菜根肿病在湖北省的发生范围和病害引起的油菜产量损失。[方法]2009-2011年间取样调查了我省沙洋县、当阳市、枝江市、宜都市和长阳县的根肿病的发生情况,通过盆栽接种试验和PCR分子检测确定根肿病。测量病区油菜根肿病的发病率,产量组成因子和小区产量,与健康区比较,评估根肿病引起的油菜产量损失。[结果]在枝江市和当阳市发现并确诊了油菜根肿病,沙洋和宜都没有发现油菜根肿病,而长阳县的根肿病主要发生在十字花科蔬菜上。发生根肿病后,油菜植株的一次有效分枝数、单株有效角果数、每角粒数和千粒重显著下降,产量损失达56.4%。[结论]湖北省油菜根肿病主要分布于枝江市和当阳市。病害的发生对油菜生长和产量造成较大影响。