十字花科蔬菜根肿病菌休眠孢子的分离与检测

 在常规分离方法的基础上,对分离自根肿组织和土壤中休眠孢子粗提液用50%蔗糖溶液进行悬浮,能成功地提取到根肿病菌的休眠孢子,可用于病原菌的繁殖、长期保存、DNA的提取及其它植物病理学研究,并能在600倍显微镜下清晰检测得到。     

十字花科蔬菜根肿病菌的PCR检测

 利用设计合成的1对根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）特异性寡聚核苷酸引物（前引物:5’GAA GAT GCC CAC GCC GTC GT3’和后引物:5’ATC TGT TCA GCA AAG CGT CGA3’）,对分离自十字花科作物（白菜、青菜、甘蓝、芥蓝、花椰菜等）及土壤中的根肿病菌全基因组DNA进行PCR（Polymerase Chain Reaction）特异性扩增试验。试验结果表明,试验设计合成的引物能从十字花科根肿病菌全基因组DNA中扩增到629 bp长度的分子片段,该对引物可用于十字花科蔬菜根肿病的分子鉴定和分子监测,为十字花科根肿病的早期准确诊断和病菌检测提供了快速、简便的方法。     

应用实时荧光定量PCR技术检测土壤中根肿病菌休眠孢子

为准确、快速、便捷检测出土壤中根肿病菌休眠孢子量,应用所建立的根肿病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测技术,测定了湖南湘潭县响水乡、长沙县路口镇、桃江县桃花江镇十字花科作物根肿病发生地的42份土样的休眠孢子数量。检测结果表明,40份土样的根肿病菌休眠孢子量为(2.76×104~4.37×106)个/g;休眠孢子量≥104个/g的土壤均有根肿病发生,而休眠孢子量为8.42×102、9.78×102个/g的2份土样未发生根肿病,说明当土壤中根肿病菌休眠孢子量≥104个/g时,根肿病害易发生。     

芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Wor.)DNA提取方法的研究与应用

芸薹根肿菌是专一的活体寄生菌,通过分子技术对其群体遗传结构研究的过程中,根肿菌DNA的提取是基础之一。利用硅藻土法和改良CTAB法从根肿菌孢子中直接提取芸薹根肿菌DNA,使用PCR技术对所得到的DNA用大白菜特异引物TCR01、检测根肿菌特异引物TC01进行检测,对2种根肿菌DNA的提取方法进行比较,采用EST-SSR分子标记对纯单孢菌系4号、10号生理小种及混合菌1,2,3,4,7,10,11,14,16号生理小种进行分析。结果表明:硅藻土法操作步骤少,较改良CTAB法操作简单;且硅藻土法提取获得DNA的PCR结果优于CTAB法,能够隔离寄主DNA。EST-SSR标记能对单孢菌4号、10号生理小种特异扩增,片段大小分别约为200bp,混合菌4号、10号生理小种扩增结果相符。H2的带型与H1中的1条带型一致,而H2、H7、H10、H11、H14和H16主带型基本一致,不同生理小种的根肿菌的变异性和致病性可能是相似的。     

应用巢式PCR检测葡萄根癌病菌

为建立葡萄根癌病菌的分子检测方法,应用细菌核糖体基因间隔片段(16S～23S ribosomal DNA intergenic spacer,ITS)通用扩增引物1405f/456r和葡萄根癌病菌ITS特异引物fI/rI,采用巢式PCR(Nested-PCR)技术对2株葡萄根癌病菌[即葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)]和10株非葡萄根癌病菌进行扩增,并且对接种葡萄根癌病菌的匍萄植株进行检测.结果表明,仅有葡萄根癌病菌能扩增出1条长度为607 bp的片段;巢式PCR检测方法可从接种15 d后的葡萄植株中特异性检测出病原菌,而病症的出现需要30～35 d的时间.说明该研究建立的巢式PCR方法可用于快速检测葡萄根癌病菌.     

根肿病菌核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用

 应用真菌核糖体基因ITS区段通用引物ITS1和ITS4,对十字花科蔬菜根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）rDNA进行PCR扩增,并将扩增到的目的片段克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行测序和碱基编码结构特点分析,结果表明:十字花科蔬菜根肿病菌ITS1区长141 bp,5.8 S区长160 bp,ITS2区长187 bp,rDNA总长为488 bp. 根据此序列设计一对根肿病菌特异性寡聚核苷酸引物（前引物:5’AGG TGA ACC TGC GGA AGG AT 3’和后引物:5’TTC AGC GGG TAA TCC TAC CT 3’）,应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术,对分离自十字花科蔬菜（白菜、青菜、甘蓝、芥蓝、花椰菜等）根肿病菌全基因组DNA进行特异性扩增试验。试验结果表明,该对引物能从十字花科根肿病菌全基因组DNA中扩增到约500 bp长度的分子片段,而对照菌株和健康对照则无扩增产物。该实验结果对有效追踪根肿病菌在田间的发生动态监测和预测预报提供了重要的信息和手段。     

十字花科根肿病菌染色及药剂致死效果测定研究

【目的】通过根肿病菌孢子悬浮液不同药剂处理致死效果测定,筛选有效药剂及检测孢子活性的染色方法。【方法】采集十字花科蔬菜根肿病病根组织制成孢子悬浮液,将不同药剂按比例加入根肿病菌孢子悬浮液中,采用台盼蓝染色孢子方法,检测药剂对根肿病菌的致死效果。【结果】19种药剂对根肿病菌孢子致死效果有明显差异,明迪、福帅得、科佳、百菌清和多菌灵等的致死率为55.99%～62.49%;其他药剂致死率为17.89%～33.89%;药剂处理随时间延长,孢子死亡率逐渐增加,致死率高低顺序14 d10 d7 d;其中明迪、福帅得、科佳、百菌清和多菌灵等处理7～10 d的致死率幅度大于10～14 d,其它药剂不同处理时间致死率差异不大。本实验测定的药剂致死效果与大田药剂防控效果基本相吻合。【结论】杀菌剂在防治根肿病菌时具有一定的时间性和滞后性,因此生产中防治十字花科根肿病要提前施药或采取预防措施,仅用单一药剂防控远远达不到持续控制目标,必须采用综合的防控措施以减轻根肿病的发生危害。     

6-BA对大白菜根肿病发病率的影响

[目的]研究细胞分裂素与大白菜根肿病的关系,探讨大白菜根肿病的发病机理。[方法]从发病植株的肿瘤提取孢子,再提取孢子DNA进行PCR检测。将鉴定出的根肿菌孢子于播种期、发芽期以及发芽后21 d接种到三角瓶内的培养土中,于发芽期在培养土中添加0.08μmol/L 6-BA。从接菌植株长出的肿瘤提取孢子,对孢子进行电镜检验,并统计6-BA处理及对照的根肿病发病率。[结果]在三角瓶内,根肿菌可引起大白菜植株发病;添加0.08μmol/L 6-BA处理的根肿病发病率为100%,未加细胞分裂素处理的发病率为57%,前者肿瘤体积也明显大于后者。扫描电镜显示大白菜根肿菌休眠孢子的大小为1.5～4.3μm。[结论]6-BA能明显促进大白菜根肿病肿瘤的形成。     

油菜根肿病菌的形态和休眠孢子的生物学特性

 【目的】比较油菜根肿病菌与十字花科蔬菜根肿病菌的形态是否存在差异。研究油菜根肿病菌休眠孢子的生物学特性，为防治油菜根肿病提供依据。【方法】应用扫描电镜观察油菜根肿病菌的形态特征和休眠孢子至管腔的形态演变过程。采用地衣红染色，观测不同根分泌物和条件对休眠孢子萌发的影响。【结果】休眠孢子近球形，有乳突，直径为1.9～4.3μm（平均3.5μm），大于甘蓝根肿菌休眠孢子（2.5μm）；透射电镜下游动孢子近球形、肾形或椭圆形，直径为1.6～3.5μm（平均2.8μm），同侧生不等长尾鞭式双鞭毛。休眠孢子萌发形成游动孢子、休止孢、休止孢再生出侵入结构管腔。休眠孢子萌发的最适温度是24℃，最适pH值是6.3，腐烂处理促进休眠孢子萌发，光抑制休眠孢子萌发，休眠孢子在过滤灭菌的根分泌物中萌发率最高为62.50％。致死温度为48℃。【结论】油菜根肿病菌与十字花科甘蓝根肿病菌休眠孢子大小有明显差异，观察到休眠孢子至管腔的过程。油菜根肿菌休眠孢子的萌发条件与该病发生条件相一致。     

土壤中落叶型棉花黄萎病菌的分子检测方法

为了建立快速、准确检测土壤中落叶型棉花黄萎病菌的方法,本试验将提取自落叶型棉花黄萎病菌菌株V991的DNA稀释成不同浓度,同时提取在灭菌土中接入不同数量的V991孢子后制成的人工病土中的DNA,并采用五点取样法提取自然土样中的DNA,选用落叶型黄萎病菌的特异性巢式PCR引物,对上述DNA样品进行检测.结果显示:采用巢式...     

棉花黄萎病菌gDNA提取方法和不同单孢的RAPD分析

选用棉花黄萎病菌代表性的菌系Ｖａ（Ｖｅｔｉｃｌｌｉｕｍａｌｂｏａｔｒｕｍ的一个菌株）和Ｖｅｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ的落中型菌系ＶＤ－８,Ｔ９及非落 叶型菌系Ｊｙ,以Ｋｅ作为实验对象,研究了ＣＴＡＢ和氯化苄２种提取方法的优劣。     

甘蔗黑穗病菌DNA提取及PCR检测

本研究利用尿素混合液直接从甘蔗黑穗病菌孢子提取基因组DNA进行PCR检测鉴定,经过反复试验,建立了一种简便、快速的检测鉴定方法。利用建立的方法对12个甘蔗黑穗病样品进行病菌基因组DNA提取,将甘蔗黑穗病菌特异性引物进行PCR检测,均扩增出大小为420 bp的预期DNA片段条带。PCR扩增产物经克隆测序,与GenBank数据库中的甘蔗黑穗病病原菌序列比对,同源性达99%。     

浙江红山茶总DNA提取及ISSR-PCR引物筛选

[目的]筛选出简易的DNA提取方法及适合于所有浙江红山茶种质材料进行ISSR分析的有效引物。[方法]采用改良的CTAB法提取基因组DNA,参考其他山茶科植物的50个ISSR引物,对来自浙江、福建、江西、安徽10个居群中共20份浙江红山茶种质材料进行了PCR扩增。[结果]改进的CTAB法可简单、快速地提取到高纯度DNA产物;筛选出的20条引物多态性丰富、条带清晰且可重复性良好。共扩增出337条DNA谱带,其中281条为多态性带,占总扩增带数的83.4%,平均每个引物扩增出16.85条谱带。[结论]所筛选的20条引物可有效应用于浙江红山茶种质资源材料的ISSR分析。     

浙江红山茶总DNA提取及ISSR-PCR引物筛选

[目的]筛选出简易的DNA提取方法及适合于所有浙江红山茶种质材料进行ISSR分析的有效引物。[方法]采用改良的CTAB法提取基因组DNA,参考其他山茶科植物的50个ISSR引物,对来自浙江、福建、江西、安徽10个居群中共20份浙江红山茶种质材料进行了PCR扩增。[结果]改进的CTAB法可简单、快速地提取到高纯度DNA产物;筛选出的20条引物多态性丰富、条带清晰且可重复性良好。共扩增出337条DNA谱带,其中281条为多态性带,占总扩增带数的83.4%,平均每个引物扩增出16.85条谱带。[结论]所筛选的20条引物可有效应用于浙江红山茶种质资源材料的ISSR分析。     

新疆刺山柑居群的RAPD多态性研究

用CTAB法提取了新疆3个不同居群刺山柑（Capparis spinosa L．）总DNA,使用RAPD技术对其进行多态性的研究。从93种随机引物中筛选出3种扩增较稳定的引物,来扩增3个不同居群刺山柑总DNA,共扩增出25条带,每种引物扩增出6～10条带;多态性条带共13条,多态性比例为52％。利用DPS软件所做的统计分析和聚类分析结果表明,3个群居间相似系数在0．69～0．86之间,平均相似系数为0．76;可聚成2类：阿克陶和乌鲁木齐居群刺山柑可聚为A类;吐鲁番居群刺山柑可聚为B类,他们彼此间的遗传变异较小。     

鹧鸪茶种质资源ISSR分子标记中的引物筛选（摘要）

[目的]为快速和准确地对鹧鸪茶种质材料进行ISSR分析提供有效引物。[方法]基因组DNA的提取采用改良的CTAB法：先用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,EB染色,以Lambda DNA/HindⅢ＋Eco RIMarkers为参照,电泳结果用Gel Doc XR型凝胶成像分析系统下照相并记录。再用Biophotometer紫外分光光度计分别测定OD_（260）和OD_（280）,并计算出OD_（260）/OD_（280）值,每份样品的OD_（260）/OD_（280）比值均要求在1.8～2.0范围内。测定每份样品DNA浓度（ng/μl）,并将其稀释至20 ng/μl,分装后置-20℃保存。利用99个ISSR引物,对来自海南岛境内的10个居群中共20份鹧鸪茶种质材料进行PCR扩增,以筛选出适合于所有鹧鸪茶种质材料ISSR分析的有效引物。[结果]从99个供试引物中共筛选出15个多态性丰富、条带清晰且可重复性良好的有效引物。用筛选出的15个引物对66份鹧鸪茶种质材料进行ISSR-PCR扩增,均可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱;15个引物共扩增出286条DNA谱带,其中231条为多态性带,占总扩增带数的80.77%,平均每个引物扩增出19.1条谱带。[结论]所筛选的15条引物可以有效地应用于鹧鸪茶种质资源材料的ISSR分析。     

Response of microbial communities to phytoremediation of nickel contaminated soils

Through pot experiment, effects of phytoremediation on microbial communities in soils at different nickel treatment levels were studied. Two Ni hyperaccumulating and one Ni tolerant species were planted in paddy soils different in Ni concentration, ranging from 100 to 1 600 mg/kg. After 110 days of incubation, soil microbial activities were analyzed. Results showed that populations of bacteria, fungus, and actinomycetes and biomass of the microorganisms were stimulated when nickel was added at a rate of 100 mg/kg in non-rhizospheric soil. When the rate was over 100 mg/kg in the soil, adverse effects on the soil microbial communities were observed. The plantation of Ni hyperaccumulating species could increase both the population and biomass of soil microorganisms, because, by absorbing nickel from the soil and excreting root exudates, the plants reduced nickel toxicity and improved the living environment of the microbes. However, different plant species had different effects on microorganisms in soil. Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) with five primers was used in this study in 25 soil samples of four types of soils. A total of 947 amplified bands were obtained, including 888 polymorphic bands and 59 non-polymorphic bands. The results indicated that the composition of microbial DNA sequences had changed because of the addition of nickel to the treated soils. Shannon-Weaver index of soil microbial DNA sequences reduced in the nickel contaminated soils with increasing nickel concentration. The changes in Shannon-Weaver index in the four types of soils ranged from 1.65 to 2.32 for Alyssum corsicum, 1.37 to 2.27 for Alyssum murale, 1.37 to 1.96 for Brassica juncea, and 1.19 to 1.85 for nonrhizospheric soil. With the same amount of nickel added to soils, the Shannon-Weaver index in rhizospheric soil with plants was higher than that in non-rhizospheric soil. Translated from Acta Pedologica Sinica, 2006, 43(6): 919–925 [译自: 土壤学报]     

不同施肥处理对毛竹根际微生物影响及其PCR-DGGE分析

采用PCR-DGGE技术对不同施肥处理毛竹根际微生物多样性特征进行研究.结果表明:采用改进的蛋白酶K-CTAB法提取的毛竹土壤DNA经PCR扩增的产物经DGGE检测后得到的电泳条带清晰且分离效果好,可以明显反映出毛竹根际微生物多样性的变化.根际微生物种群组成特征受施肥量、肥料种类影响很大,施肥能够增加毛竹根际微生物的多...     

不同花色铁棒锤基因组DNA提取及遗传差异分析

利用RAPD-PCR技术对不同花色的铁棒锤植物进行遗传差异分析,旨在为今后铁棒锤的引种驯化及品种选育提供参考。采用CTAB法,从铁棒锤植物不同材料提取基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测所得总DNA的浓度和纯度,并用20条RAPD随机引物进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明,CTAB法从铁棒锤的新鲜叶片及干燥种子中均可提取出基因组DNA,但前者DNA的质量好、产量高;有3条引物可以扩增出条带,其中,引物E68629的扩增产物清晰稳定,可用于铁棒锤遗传差异分析。RAPD分析结果表明,2种花色铁棒锤在分子水平上具有遗传学差异。     

土壤微生物分子生态学研究中总DNA的提取

建立了一种土壤DNA提取方法。根据DNA产量和纯度2个评价指标，从3种手提土壤DNA方法中优选出方法B为手提DNA方法（Lab method），它包括样品预处理，细胞裂解，粗DNA纯化，其中细胞裂解组合了玻璃珠击打．SDS裂解，溶菌酶裂解。进一步应用PCR-限制性片段长度多性（Restriction fragmentlength polymorphism，RFLP）技术及PCR-温度梯度凝胶电泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）技术．结合DNA产量、纯度、片段大小以及所反映的微生物群落结构特性等指标评价了手提方法（Labmethod）得到的总DNA质量，并将这些结果与2种应用较广的商业试剂盒（Mo Bio UhraClean Soil DNA Kit和Bio 101 FastDNA SPIN Kit（For Soil1）所得DNA的各种指标进行了比较。结果表明，手提方法（Labmethod）的粗DNA产量低于Bio 101 Kit的，但高于Mo Bio Kit的。这些方法所得DNA的长度都在21kb左右，Labmethod提取的DNA没有严重被剪切现象，而2种试剂盒提取的DNA都有不同程度的剪切。手提方法得到的DNA经纯化后，应用细菌及真菌特异引物进行PCR扩增，均能获得目的片段，表明该方法能从土壤中同时有效提取细菌和真菌总基因组DNA。并且，手提方法所得DNA的细菌16SrDNA和真菌18SrDNA的PCR-RFLP图谱与两种商业试剂盒的图谱基本相似，但3种方法提取的DNA在细菌16S rDNAV3区和真菌28SrDNA片段的PCR-TGGE图谱上都存在一定差异．主要表现在一些弱势条带的有无或强弱上。这说明手提方法提取的总DNA与2种商业试剂盒一样，在一定程度上能反映微生物群落的多样性和组成。总之，手提DNA方法（Lab method）所用试剂普通，价格便宜，能在4h以内获得够质够量的土壤DNA用于微生物分子生态学研究，较适合于广大普通实验室进行土壤DNA提取工作。