反义RNA介导的抗猪传染性胃肠炎病毒感染

构建了重组逆转录病毒表达质粒plxas-N,该质粒能表达互补猪传染性胃肠炎病毒N基因全长的反义RNA序列。用质脂体方法将重组质粒plxas-N转染至PA317细胞中,经抗生素G418(500μg/ml)筛选出稳定的产毒细胞克隆。分别扩大培养细胞克隆,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的重组病毒滴度,并用高滴度重组病毒感染IBRS2细胞。提取被感染的IBRS2细胞的总RNA,RT-PCR证明plxas-N整合到IBRS2细胞基因组。通过TGEV分别感染IBRS2和IBRS2抗性细胞产生的病变,结果表明该反义RNA对病毒的复制有抑制作用,其抑制率近50%。     

正粘病毒118毒株的特性鉴定

外表健康鸭的粪便接种鸡胚,分离到一株具有血凝活性的病毒,暂称118毒株。病毒颗粒多数呈不规则圆形,直径80～130纳米,有囊膜,膜上有无数排列规则的纤突,其长度约为10纳米。将病毒接种鸡胚成纤维细胞培养可引起明显的细胞病变,特征为大部分细胞变圆,折光力增强,细胞质内有小颗粒积聚。本病毒对乙醚很敏感,50℃30分钟能将其灭活,MgCl_2对它无保护作用,对pH3敏感。5-碘-2′-脱氧尿核苷不能抑制其生长。本病毒不能溶解鸡的红细胞。根据本试验所得结果和血凝抑制试验,本病毒可能是一种目前国内新发现的正粘病毒。     

牛病毒性腹泻/黏膜病

<正>牛病毒性腹泻/黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒引起的,主要发生于的一种急性,热性传染病,其临床特征为黏膜发炎,糜烂,坏死和腹泻。本病简称牛病毒性腹泻或牛的黏膜病。1病因牛病毒性腹泻病毒又名黏膜病病毒是黄病毒科瘟病毒属的成员。为单股RNA,有囊膜的病毒,直径50-80nm,呈圆形。本病毒能在胎牛肾,睾丸,肺,皮肤,肌肉,鼻甲,气管及猪肾等细胞培养物中增殖传代,也适应于牛肾传代细胞系。BVDV株中有的能引起培养细胞形成空泡及死亡,有的毒株只能使培养细胞产生     

一种新的鸭病（暂名鸭出血性坏死性肝炎）病原学研究初报

从临床表现为肝脏不同程度点/斑块状出血和坏死为主要病变的病死雏番鸭、雏半番鸭和雏麻鸭肝脾组织中分离到8株病毒。分离毒能致死番鸭胚和鸡胚,胚体充出血、胚肝肿大出血坏死;人工感染1-2日龄雏番鸭、雏半番鸭均能复制出与临床自然发病鸭相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒;分离毒能在MDEF中增殖并产生细胞病变,经电镜观察,病毒在细胞浆中增殖,呈大量散在、成堆和晶格状排列,病毒粒子呈球形、二十面体对称、无囊膜、双层衣壳、直径70nm左右;分离毒不能凝集鸡和鸽红细胞,对乙醚、氯仿、FUDR不敏感;病毒核酸为dsRNA,在SDS-PAGE中具有禽呼肠孤病毒10个RNA片段的特征(L1-3、M1-3 和 S1-4);应用MDRV特异性引物不能从分离毒中扩增出任何条带;鉴于分离毒的上述特性,暂将此分离毒归属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型鸭呼肠孤病毒。     

鸡肺泡上皮Ⅱ型细胞的培养与鉴定

为研究禽流感等敏感病毒及其他致病因子对肺泡上皮Ⅱ型细胞(AEC-Ⅱ)的致病性,建立了鸡AEC-Ⅱ细胞体外培养方法.采用胰蛋白酶和Ⅳ型胶原酶联合消化法时 18 日龄鸡胚肺组织进行消化,经差速离心和免疫黏附,获得了鸡 AEC-Ⅱ细胞,再经纯化、体外培养和碱性磷酸酶染色法鉴定.结果表明,鸡AEC-Ⅱ细胞在接种后18 h开始贴壁进入适应期,细胞为圆形,呈岛屿状生长;接种后 24～72 h,进入对教生长期,细胞为多边形,并融合成单层,胞浆内有明显的颗粒;接种后第 4 天细胞数量达到高峰(1.38 × 105个/mL),并进入稳定生长期,胞浆内颗粒开始减少;接种后6～7 d,细胞进入衰退期,胞浆内颗粒显著减少,细胞逐渐死亡、脱落.另外,4代(F4)之前的AEC-Ⅱ传代细胞贴壁时间早,形态均一,纯度高.说明接种后24～72 h内获得的AEC-Ⅱ原代细胞和F4之前的传代细胞可以供体外试验研究.     

鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性研究

收集福建某渔场的患病石斑鱼苗制备组织切片,同时将患病石斑鱼苗组织匀浆后接种到条纹月醴细胞系(striped snakehead, SSN-1),对发生细胞病变(cytopathic effects, CPE)的SSN-1细胞进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、纯化负染,并制备细胞超薄切片,借助SSN-1细胞系从患病石斑鱼苗中分离病毒性神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV).试验结果表明:在病鱼脑和视网膜中可见大量的空泡,接种SSN-1后2～3d出现CPE,PCR检测可扩增出VNNV特异性带,提示这是VNNV病毒.负染及SSN-1细胞超薄切片的电镜观察显示,该病毒为直径25～30nm的二十面体病毒粒子,在胞质中呈不完全晶体状排列,同时细胞质中有大量空泡,进一步说明分离株为VNNV.对该分离株进行细胞敏感性试验、脂溶剂敏感试验(氯仿处理)、热敏感试验(55℃ 30min)、酸碱敏感试验(pH值为3和pH值为11各1h),试验结果表明:石斑鱼吻端细胞、鲤上皮瘤细胞、肥头鲤细胞在28℃、25℃、20℃时对该病毒都不敏感;该病毒对氯仿不敏感,对热和酸碱都比较敏感.研究结果表明,用SSN-1细胞系可以从患病鱼中分离VNNV.     

一种新的丹顶鹤病毒病的研究

本病是在我国发现的尚未见报道的丹顶鹤病毒性传染病。患鹤肝脏肿大。实验表明,人工感染雏鹅和成年鹅能引起发病和死亡;该病毒还可致死鹅胚、鸭胚和鸡胚,并能在鹅胚和鸭胚成纤维细胞上产生细胞病变。该病毒有囊膜,呈球形,大小约为130-180nm,无囊膜颗粒为95-105nm在CsCl里浮密度为1.29-1.34g/cm#+3,沉降系数为83.4s,对pH3.0敏感,而对pH5.0有抵抗力,1克分子MgCl#-2溶液对病毒无保护作用。该病毒不凝集禽类及动物红细胞。中和试验表明本病毒与小鹅瘟病毒、新城疫病毒、鸡马立克氏病病毒、法氏囊病病毒、鸭瘟病毒、小鸭肝炎病毒和猪瘟病毒没有抗原关系。     

狂犬病病毒Flury株(LEP)在乳鼠脑内及BHK-21细胞上的传代固定及生物学特性测定

将狂犬病病毒Flury株(LEP)通过乳鼠脑和BHK-21细胞系交叉传代10代,并对交叉传代获得的各代毒种进行对细胞的适应性、病毒含量、毒力的测定。结果表明:病毒经乳鼠脑内传代后,能很好的在BHK-21细胞上增殖,各代次病毒含量均在10-6.0TCID50/0.1 mL以上,平均达到10-6.75TCID50/0.1 mL;对3～5日龄乳鼠平均LD50达到10-5.5/0.03 mL,对11～13g小鼠平均LD50达到10-4.6/0.03 mL;毒力试验证明,交叉传代的细胞毒对犬和家兔无致病性。     

草鱼出血病毒H962毒株的生物学特性研究

为了从细胞水平上研究人－α干扰素对草鱼出血病毒（ＧＣＨＶ）的抗性作用,以草针出血病毒Ｈ９６２毒株进行了稀有Ｊｕ鲫感染试验及细胞病变敏感细胞试验,研究了该毒株的某些生物学特性及不同细胞素。结果表明：该病毒能使稀有Ｊｕ鲫发生出血病,症状明显,死亡率高。感染草鱼肾细胞,能引起细胞病变,但经传代后,病变消失,表现出病变不稳定特点,感染鲤鱼上皮细胞、稀有Ｊｕ鲫性腺细胞、草鱼鳍条细胞和草鱼性腺细胞,不引起细胞     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病原特性与多肽分析

从患传染性腺胃病的病鸡中分离到４株病毒,其中Ｈ９５株在ＳＰＦ鸡胚上已稳定传代。病料及Ｈ９５传代后的鸡胚尿囊液经工和ＣｓＣｌ密度梯度离心后的纯化物,电镜下为大小８０－１６０ｎｍ、有囊膜的病毒颗粒、囊膜表面有纤突,呈冠状形态。病毒在ＣｓＣｌ中的浮密度为１．１９－１．２３ｇ／ｃｍ＾３,对热和氯仿敏感,而酸,能抵抗１％胰酶,无直接血凝性,经卵磷脂酶Ｃ处理后的病毒则能凝集鸡红细胞,能干扰新城疫病毒在鸡胚上的     

四株猪轮状病毒对不同细胞的感染性试验

测定了４株狸轮状病毒对７株传代细胞和１１种原代细胞的感染敏感性。结果是：四株猪轮状病毒，都能迅速适应于ＭＡ１０４传代细胞株上生长敏殖，并能连续传至数十代以上，耐对其他的传代细胞和原代细胞均不适应。     

鸡传染性法氏囊病毒在DF-1细胞系上繁殖特性研究

对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV) HQ株在DF-1细胞上的适应及增殖条件进行了研究,结果表明,HQ株不适应在Vero细胞上生长,而在DF-1细胞上能够很好的适应.经培养条件优化,最终选用pH值为7.0,血清含量体积分数为2％的DMEM/F12培养基做维持液,在细胞传代后第2天接种IBDV HQ株,接毒量为1％(约0.7...     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病原特性与多肽分析

从患传染性腺胃病的病鸡中分离到4 株病毒,其中H95株在SPF鸡胚上已稳定传代。病料及H95 传代后的鸡胚尿囊液经蔗糖梯度和CsCl密度梯度离心后的纯化物,电镜下为大小80～160 nm 、有囊膜的病毒颗粒,囊膜表面有纤突,呈冠状形态。病毒在CsCl中的浮密度为1.19～1.23 g/cm 3, 对热和氯仿敏感,耐酸,能抵抗1% 胰酶,无直接血凝性,经卵磷脂酶C处理后的病毒则能凝集鸡红细胞,能干扰新城疫病毒在鸡胚上的增殖。应用杂交瘤技术筛选出4 株抗H95株的阳性克隆,经Western blotting, 其中3 株单抗能识别54 kd 蛋白多肽,该条带也能与来自鸡传染性支气管炎病毒(IBV) M41 株的针对N 蛋白的单抗反应。中和试验表明, H95株与其它IBV 毒株在血清型上存在差异。上述研究结果初步表明,鸡传染性腺胃病的病原是冠状病毒科的成员,并且很可能是鸡传染性支气管炎(IB)中以腺胃病变为主要特征的一种新的致病病型。     

猪瘟病毒2.1b基因亚亚型野毒株的体外细胞传代适应与全基因组序列分析

利用RT-PCR从广东某猪场疑似猪瘟(Classical swine fever,CSF)病例中检测出CSFV,并对扩增的E2全长基因进行了序列测定和系统进化分析。结果表明:引发该起猪瘟疫情的毒株属于CSFV 2.1b基因亚亚型,命名为GD176。为了进一步了解该毒株的复制特点,利用PK-15细胞对GD176进行了体外细胞适应性传代,并对获得的细胞适应毒GD176-F46进行了全基因组测序。结果表明:GD176通过在PK-15上不断传代,最终获得了高滴度的适应毒株,其滴度从第6代的102.61TCID50/m L提高至第46代的108.06TCID50/m L。病毒生长动力学结果显示,GD176-F46在感染后72 h病毒滴度达到最高值(108.17TCID50/m L)。为进一步分析GD176在细胞传代适应过程中的稳定性,对不同代次细胞毒的E2全长基因进行扩增和序列测定,结果发现:GD176-F0与GD176-F6、F10、F15、F20、F25、F30、F35、F40和F46的E2基因序列完全一致,这表明囊膜蛋白E2在病毒适应PK-15细胞过程中非常稳定。通过比对GD176和其他2.1亚型毒株各蛋白的氨基酸序列发现,不同毒株之间同源性最小的病毒蛋白是NS5A,低于病毒囊膜糖蛋白E2。获得了高度适应PK-15细胞的GD176细胞毒,为进行病毒毒力评价、复制和致病特性研究奠定了基础。     

猪细小病毒的分离与鉴定

利用ST细胞对采集的猪木乃伊胎儿内脏进行病毒分离,ST细胞产生规律性病变,表现为细胞圆缩、拉网、灶性脱落等变化;分离毒适应于ST细胞培养,并可凝集豚鼠红细胞,TCID_(50)随着传代次数升高而逐渐增高;分离毒能被PPV特异性阳性血清中和,而不能被PPV阴性血清中和;对细胞培养物进行PPV荧光抗体染色可见特异性荧光,理化特性试验证实分离毒对温度、酸碱不敏感,对乙醚、氯仿等脂溶性溶剂具有较强的抗性,并能抵抗短时间的胰酶处理;接种豚鼠可产生PPV HI抗体。试验结果证实分离毒为猪细小病毒。     

Marc-145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较

采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc-145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力.结果表明,通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作,Marc-145细胞可完全适应含5％新生牛血清的营养条件,经3次传代后,Marc-145细胞可营正常贴壁生长.然而在1％新生牛血清的营养条件下,初次培养于该条件的Marc-145细胞伪足不伸展,贴壁时间明显延长.经过在该1％血清浓度下10次传代后,Marc-145细胞可贴壁生长,维持较高的存活率,但贴壁较松.由此Marc-145细胞进一步驯化适应无血清悬浮培养条件,筛选获得能够在无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞,且生长状态良好.比较在不同血清浓度及不同培养方式下生长的Marc-145细胞增殖PRRSV的能力,无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞对PRRSV的增殖性能没有改变.     

IB——Rs_2传代细胞的超低温保存试验

<正> IB-RS_2系传代细胞来源于猪肾的异倍体细胞,是病毒繁殖的理想宿主.目前它的培养物已广泛地用于病毒分离、疫病诊断、病毒抗原的生产和疫苗制造.我所继猪乙型五号病兔毒灭活苗研制成功后,为进一步提高疫苗产量,降低成本,于1981年开始了细胞苗的研究.但由于IB-RS_2是由染色体数目不同的若干异倍体细胞组成的"嵌合"细胞群体(mosaic Cell Population),加之在传代培养过程中各种因素的影响,会引起细胞染色体数目的改变从而使遗传性发生变异,导致细胞形态变化,最终影响对病毒的敏感性.这就需要限制细胞传代次数,控     

兔病毒性出血症病毒敏感细胞株的初步选择

将兔出血症病毒分别接种于Vero E_6、Vero、RK_(13)、LLC—MK_2、A_(549)、ZBS细胞进行盲传培养。在细胞传代时制备抗原片。根据间接免疫荧光检查结果,初步认为Vero E_6和LLC—MK_2是本病毒敏感细胞株。     

凤尾菇病毒性质的研究

感染病毒的凤尾菇菌丝体外观和生长无异常现象。但子实体出现畸型,产量降低。用聚乙二醇沉淀病毒粒子,经磷钨酸负染,在电子显微镜下放大170000倍,可观察到30nm的球形病毒颗粒。用酚和氮仿提取病毒核酸,再经SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染,可观察到5条特征性核酸节段。病毒核酸对DNase不敏感,热变性后呈增色效应,能被RNase降解,高盐浓度下抗RNase。结果表明,凤尾菇病毒为双链RNA病毒。含病毒的菌丝体经高温处理,挑取菌丝生长尖端,未能消除病毒。     

表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa^[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF（moi=0.01）,每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10^6.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.5TCID₅₀/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。