Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana来源的碱性蛋白酶在毕赤酵母中的异源表达与性质测定

碱性蛋白酶作为广泛应用的蛋白酶之一,具有重要的工业应用价值。发掘优质的碱性蛋白酶基因,实现其高效表达,有助于更好的满足工业应用需求。分别将Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana来源的碱性蛋白酶基因pa1及pa2与表达载体pPIC9连接,并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。对于纯化后的重组蛋白PA1及PA2的酶学性质进行测定,二者最适pH均为8.5,最适温度均为60 ℃,与同类酶相比具有一定的优势;PA1及PA2的温度稳定性较好,50 ℃下酶活保持稳定,60 ℃下处理10 min,二者均保持70%左右的酶活;PA1及PA2的pH耐受范围宽泛,在pH 4.0~11.0的环境中处理1 h,均能保持80%以上的活性。此外,PA1及PA2对于表面活性剂和还原剂也表现出一定的耐受性。这些性质都表明PA1及PA2是具有工业应用潜力的优质碱性蛋白酶。     

菌株I13产碱性蛋白酶的酶学性质研究

[目的]研究菌株I13产碱性蛋白酶的酶学性质.[方法]从一株碱性蛋白酶生产菌株I13中得到了碱性蛋白酶粗酶液,并研究了温度和pH值对该酶液酶活力的影响.[结果]所产碱性蛋白酶的最适反应温度为40℃,但在30～60℃范围内活力水平均较高,且在20～30℃范围内也保持了最大活力的40%以上;最适反应pH值为10.5,在8.0～11.0 pH值范围内保持了最大活性的90%以上,有较宽的pH值谱.[结论]该碱性蛋白酶具有开发成为洗衣粉添加剂的巨大潜力.     

菌株Ⅰ13产碱性蛋白酶的酶学性质研究（摘要）

[目的]研究菌株I13产碱性蛋白酶的酶学性质。[方法]从一株碱性蛋白酶生产菌株I13中得到了碱性蛋白酶粗酶液,并研究了温度和pH值对该酶液酶活力的影响。[结果]所产碱性蛋白酶的最适反应温度为40℃,但在30～60℃范围内活力水平均较高,且在20～30℃范围内也保持了最大活力的40%以上;最适反应pH值为10.5,在8.0～11.0pH值范围内保持了最大活性的90%以上,有较宽的pH值谱。[结论]该碱性蛋白酶具有开发成为洗衣粉添加剂的巨大潜力。     

菌株I13产碱性蛋白酶的酶学性质研究

[目的]研究菌株I13产碱性蛋白酶的酶学性质。[方法]从一株碱性蛋白酶生产菌株I13中得到了碱性蛋白酶粗酶液,并研究了温度和pH对该酶液酶活力的影响。[结果]所产碱性蛋白酶的最适反应温度为40℃,在20~30℃范围内仍保持了最大活力的40%以上;最适反应pH为10.5,在pH 8.0~11.0范围内保持了最大活性的90%以上,有较宽的pH谱。[结论]该碱性蛋白酶具有开发成为洗衣粉添加剂的巨大潜力。     

Bispora sp.MEY-1来源的新型嗜热多聚半乳糖醛酸酶的酶学性质研究及其应用评估

果胶酶作为添加剂广泛应用于食品行业的果汁澄清工艺中,发现和挖掘适用于工业应用的优质果胶酶,能够为工业应用提供更多的选择。从嗜酸的Bispora sp.MEY-1基因组中克隆得到一个多聚半乳糖醛酸酶基因Bspg28b,并在毕赤酵母GS115中实现高效异源表达。对重组蛋白纯化后进行酶学性质的测定,其最适pH 3.5,最适温度为65℃,在酸性至中性的环境中具有很好的pH稳定性,完全满足果汁澄清工艺的需求;BsPG28b在55℃下保持高度稳定,在65℃中保温10 min后仍能剩余50%的酶活,是真菌来源中少见的耐高温优质果胶酶。对BsPG28b的应用效果进行评估发现,可显著提高葡萄汁的澄清度,体现巨大的应用潜力。     

Bispora sp. MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA酶学性质研究

酸性海藻糖酶作为生物催化剂在生物工业中广泛应用，挖掘酶学性质优良的酸性海藻糖基因具有重要意义。从Bispora sp. MEY-1中成功克隆出一个酸性海藻糖酶基因TreA，并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。对纯化后的酸性海藻糖酶TreA进行酶学性质鉴定，其最适pH为4.0，在pH 2.2~5.0范围内，该酶能够维持60%以上的酶活力。TreA在偏酸条件下稳定效果比较好，在pH 1.0~4.0条件下处理1 h，可以剩余88%以上的酶活力。TreA的最适温度为60 ℃，在40~70 ℃之间都可以维持50%以上的酶活力，属于中高温酶。重组海藻糖酶TreA的比活为1 913 U·mg^-1，动力学参数Km和Vmax分别为0.67 mg·mL^-1和119 μmol·min^-1·mg^-1。同时，还评估了不同金属离子或化学试剂对纯海藻糖酶TreA的酶活性影响及其蛋白酶抗性。极大丰富了海藻糖酶基因资源，促进了其在生物工业中的应用。     

维氏气单胞菌几丁质酶ChiC的性质和与几丁质结合蛋白协同作用的研究

为了探索维氏气单胞菌B565低酶活几丁质酶ChiC的性质及突破其低酶活的应用瓶颈,构建了重组ChiC毕赤酵母工程菌GS115/PIC9\|ChiC,进行甲醇诱导表达纯化,研究其基本酶学性质。结果表明,ChiC在毕赤酵母中分泌表达,甲醇诱导48 h后,达到摇瓶水平最大表达量232.6 mg/L。ChiC最适反应pH为8.0,温度为40℃。最适反应条件时比活力为7.6 U/mg。ChiC具有较宽的pH及温度适应性,在pH 3.0~10.0,40℃或者0~40℃,pH 7.0, 均可以保持80%以上最适酶活力。同时几丁质结合蛋白CBP21于大肠杆菌中实现胞内可溶表达,其表现出对虾壳几丁质和胶体几丁质的具有不同的结合能力。但CBP21促进ChiC降解胶体几丁质的能力(提高约9倍)明显高于其促进ChiC降解虾壳几丁质的能力(提高约2倍)。上述结果为该几丁质酶基因的深入研究奠定了理论基础,为突破该低酶活几丁质酶的应用瓶颈提供了一种可能的解决方案。     

脱毛碱性蛋白酶的纯化及其生化特性研究

采用CM-阳离子交换层析和凝胶过滤层析分离碱性蛋白酶,得到了碱性蛋白酶的单一组分。对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶SDS-聚丙烯酰胺电泳进行了分析。结果表明：其亚基分子量约为28kD,等电点约为8．4。并对其生化特性质进行研究,结果表明：酶活最适温度为45℃,最适pH值为10．5,在0．5mol／L的Na^ 对酶活有较大的促进作用。     

普鲁兰短梗霉N2-3菌株碱性蛋白酶的纯化及性质研究

[目的]对普鲁兰短梗霉N2-3菌株的碱性蛋白酶进行纯化,并对其性质进行研究。[方法]利用层析柱Sephadex G-75与阴离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow纯化菌株N2-3的胞外碱性蛋白酶,并对纯化的酶进行SDS-PAGE凝胶电泳检测,同时对纯化蛋白酶的最适反应温度、温度稳定性、最适反应pH、pH稳定性进行测定,研究金属离子及各种化合物对蛋白酶活性的影响。[结果]试验中N2-3菌株的碱性蛋白酶纯化倍数和回收率分别为2.34和25.9%;SDS-PAGE凝胶电泳显示该酶的分子量约为33 kDa;该酶的最适反应温度和pH分别为52℃和9.0;Mn2+、Mg2+、Na+离子浓度在5 mmol/L时对纯化蛋白酶的酶活有激活作用,Zn2+、Ca2+、K+、Li+对酶活的影响不大,而当存在Fe2+、Fe3+、Cu2+、Co2+、Ag+、Hg2+离子时,蛋白酶活明显降低;苯甲基硫酰氟(PMSF)强烈抑制了该蛋白酶的活性,而乙二胺四乙酸(EDTA)与碘乙酸微弱抑制了该蛋白酶的活性。[结论]为普鲁兰短梗霉N2-3菌株碱性蛋白酶的工业化生产提供了一定的理论基础。     

碱性脂肪酶产生菌的发酵条件及酶学性质研究

研究1株碱性脂肪酶产生菌L198发酵条件及酶学性质.结果表明,产酶发酵培养基为(;):豆饼粉1.0,玉米浆1.0,葡萄糖1.0,K2HPO4 0.5,NaNO3 0.5.500 mL三角瓶装液50 mL,30℃,180 r/min摇床培养40 h.酶学性质研究:最适反应温度为40℃,最适pH 9.0;在pH 8～10稳定.其热稳定性较好,在20～40℃放置6 h后仍可以保持较好酶活力.金属离子Na+、 K+对酶活有显著激活作用,而Cu2+对酶活有显著抑制作用,而K+、Mg2+、Fe+对酶活有抑制作用.     

海洋氧化短杆菌15E碱性蛋白酶的酶学性质

对氧化短杆菌15E菌株(Brevibacterium oxydans)所产的碱性蛋白酶酶学性质研究表明,15E菌株所分泌的碱性蛋白酶分子质量为49.0 ku、等电点为9.3.该酶的最适作用温度为60℃,最适pH值为7.0-9.0;Ca2+、Mg2+、K+对酶有激活作用.酶对一些变性剂如SDS、尿素、盐酸胍具有一定的耐受性;PMSF和AEBSF能抑制该蛋白酶,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶;EDTA对该蛋白酶有抑制作用,说明该蛋白可能含有金属离子.     

米糠蛋白抗氧化肽的制备及初步分离

试验以米糠蛋白为原料,制备米糠蛋白抗氧化肽。以DPPH自由基清除率为指标,采用正交试验,优化碱性蛋白酶酶解米糠蛋白制备抗氧化肽的工艺条件;采用超滤、SephadesG-25柱层析分离纯化米糠蛋白抗氧化肽。试验结果表明,制备米糠蛋白抗氧化肽的最优工艺条件为：酶解温度45℃,pH9．0,时间60rain,米糠蛋白底物浓度3％,碱性蛋白酶加酶量3000U·g-1。在米糠蛋白酶解产物中,Mrs〈5KDa组分的抗氧化活性最强,其对DPPH自由基清除率为68．7％。通过SephadexG-25凝胶层析柱进一步分离得到4个混合组分,混合组分Ⅱ活性最强,其DPPH自由基清除率为75．83％。     

Neosartorya fischeri P1来源的外切聚半乳糖醛酸酶异源表达及性质研究

聚半乳糖醛酸酶在食品和饲料行业具有很大的应用价值,发现新的聚半乳糖醛酸酶不仅能够补充该酶的相关信息,还能为工业应用提供更多选择。从一株嗜热费希新萨托菌(Neosartorya fischeri P1)的基因组中克隆得到一个外切聚半乳糖醛酸酶基因(Nf-pg),将Nf-pg在毕赤酵母GS115中进行异源表达,重组酶Nf-PG纯化后进行性质测定。Nf-PG在p H 4.5和55℃时活性最高,在p H 2.0~9.0具有较好的稳定性,50℃热处理60 min仍能保持80%的剩余酶活;去除N-糖基化的酶蛋白Nf-PG-D最适温度为50℃,热稳定性降低,最适p H和酸碱稳定性无明显改变。产物分析证明Nf-PG是严格的外切聚半乳糖醛酸酶,优异的性质使其成为食品加工行业的良好选择。     

粗糙脉孢菌GH45家族内切纤维素酶基因ncGH45在毕赤酵母中表达及重组酶的性质表征

纤维素酶作为一种重要的糖苷水解酶,在生物质能源生产、饲料、造纸、洗涤和纺织领域都有着非常广泛的应用。粗糙脉孢菌来源的GH45家族内切纤维素酶基因(nc GH45)全长935 bp,包含一个53 bp的内含子(339-391),编码272个氨基酸,包括一个N-端的GH45家族催化结构域和C-端的1家族碳水化合物结合结构域。该基因在毕赤酵母中得到了分泌表达,且表达蛋白条带单一,酶活性达到20 U/m L。重组酶r Nc GH45的最适p H为4.5~5.0,最适温度为60~65℃,并且在较宽的p H范围(p H 4.0~8.0)和温度范围(30~70℃)都能维持75%以上的酶活。在37℃和50℃,p H 3.0~11.0都有着非常好的稳定性;该酶的热稳定性非常好,在70℃和80℃处理2 h还能剩余89.6%和77.7%的酶活,即使在沸水中煮10 min还能剩余10%的酶活。r Nc GH45的最适底物是地衣多糖(1 116.0 U/mg),其次是大麦葡聚糖(754.2 U/mg)和CMC-Na(254.6 U/mg),对大麦葡聚糖和CMC-Na的动力学常数Km和Vmax分别为6.26 mg/m L和997.4μmol/mg·min,19.96 mg/m L和722.1μmol/mg·min。水解产物分析结果表明,r Nc GH45对多糖的水解产物主要是纤维五糖,对寡糖的最小作用底物是纤维三糖,而对纤维二糖没有作用。对纺织品脱毛实验的结果表明,酶的添加量为10 U时,减量率为1.55%。上述结果表明成功构建了r Nc GH45高效表达工程菌株,表达的重组蛋白性质优越,有着良好的工业应用前景。     

解淀粉芽孢杆菌LC03 的分离及其芽孢漆酶性质研究

为获得性能优良的细菌漆酶,利用含铜富集培养基从森林土壤中分离到一株具有较好漆酶活性的细菌菌株 LC03,经生理生化实验和16S rDNA 序列分析鉴定为解淀粉芽孢杆菌。该菌株培养6 d 后的芽孢漆酶活性最高,可 达48.5 U/ g。菌株LC03 的芽孢漆酶氧化底物2,2忆鄄联氮鄄双鄄(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸) (ABTS)和丁香醛连氮的最 适pH 值分别为3.8 和6.8,以丁香醛连氮为底物时的最适反应温度为60 益。该芽孢漆酶具有较好的稳定性,经70 益处理10 h 或pH 9.0 条件下放置10 d 仍能保持漆酶活性,同时对抑制剂SDS 和EDTA 具有一定的抗性。Li+ 、 Na+ 、Mg2 + 、Ca2 + 、Ba2 + 、Al3 + 对漆酶活性有促进作用,Ag+ 、Mn2 + 、Hg2 + 、Co2 + 对其抑制作用比较明显。解淀粉芽孢 杆菌LC03 的芽孢漆酶在高温和碱性条件下优良的稳定性为其在工业废水处理等领域的应用奠定基础。      

毛霉ZG2菌株产蛋白酶条件优化

对毛霉ZG-2菌株的产蛋白酶条件进行优化,以便于生抽大曲的大规模生产。结果表明,在大豆粉40%、麸皮60%、加水100%(V/m)、温度40℃条件下,制成的大曲蛋白酶活性最高,其中酸性蛋白酶酶活2 314U/g、中性蛋白酶酶活4 602U/g、碱性蛋白酶酶活1 352U/g;加120g/L食盐水溶液进行稀醪发酵60d,原料蛋白质转化率最高,达79.3%。     

基于响应曲面法优化蜂胶的乙醇提取工艺

蜂胶具有优良的保健效果,一直被作为功能食品而加以应用。为了满足实际生产中提高蜂胶产品质量和生产效率的要求,在充分模拟实际生产条件的基础上,利用响应曲面法对蜂胶提取率和总黄酮含量的影响因素（提取时间、乙醇浓度、固液比、提取次数、提取温度）进行了分析。结果表明,针对本实验中采用的蜂胶毛胶样品,回归模型预测的蜂胶提取率达到38.324 6%,总黄酮含量达到199.776 0 mg/g;最佳提取条件为提取时间24 h,乙醇浓度95%,固液比1∶10,提取次数2次,提取温度为室温。为了达到指导实际生产的目的,试验结论须得到生产车间的实际检验。