水稻几丁质酶的表达及其酶学基本性质

利用甲醇诱导重组Pichia pastoris在发酵罐中表达几丁质酶,在发酵过程中根据溶氧变化控制甲醇流加速度.结果显示,蛋白表达量随菌体密度的增加而增加,酶活最高达56 U/ml.该几丁质酶具有良好的耐热性和pH适应性,在pH 2.0和pH 5.0有2个最适反应pH;在pH 3.0稳定性最好;40 ℃为其最适反应温度;在60 ℃保温3 h仍保持81%的酶活性;该几丁质酶对病原菌生长有一定程度抑制作用.     

海洋产几丁质酶菌株的筛选及发酵条件优化

通过透明圈法初筛、DNS复筛,从大连近海海域的海泥中分离出一株高产几丁质酶的菌株,经初步鉴定为扩展短杆菌(Brevibacterium linens).采用不同碳源、氮源、温度、pH值等对培养条件进行了优化及正交试验.结果表明:该菌产酶最适条件是在28℃、pH7.0、蛋白胨1g/L、胶体几丁质10g/L、NaCl 20g/L条件下,几丁质酶活力可达0.508 U/mL,比优化前其产酶活力提高了9倍.     

淡紫拟青霉MD1几丁质酶活性测定

应用胶体几丁质平板透明圈法和DNS法测定了淡紫拟青霉MD1的几丁质酶活性,首次获得淡紫拟青霉在胶体几丁质平板上的透明圈,DNS法测定MD1几丁质酶活性结果表明,粗酶液无论是否有几丁质诱导,MD1菌株的几丁质酶活力均在第7 d最高,而且几丁质诱导的粗酶液酶活明显比同期未经几丁质诱导的粗酶液酶活高.     

盾壳霉几丁质酶和葡聚糖酶酶动力学性质初步研究

盾壳霉几丁质酶和葡聚糖酶酶动力学性质研究表明:几丁质酶和葡聚糖酶的酶促反应,在本试验计量范围内,其反应速度与酶量和底物浓度均呈正相关,但两种酶促反应适宜的温度和pH值有较大差。几丁质酶降解几丁质的最适反应温度为50℃,最适pH值为8.0,葡聚糖酶降解葡聚糖的最适反应温度为60℃,最适pH值为3.0。     

重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶gene02524的酶学性质及抑菌活性

几丁质酶是催化降解几丁质的水解酶,在防治植物真菌病害与虫害方面的应用越来越广泛,是一种重要的生防蛋白。棘孢木霉TD3104是一株优良的植物病害生防菌,几丁质酶在抑菌防病过程中发挥重要作用。为克隆表达棘孢木霉TD3104几丁质酶基因gene02514,明确酶学性质和抑菌活性,利用毕赤酵母表达系统对目的蛋白进行表达,并通过SephadexG-100凝胶进行纯化,对序列进行分析并研究其酶学性质及进行体外抑菌试验。本研究成功地构建了pPIC9K/gene02524重组载体,并且经过比对发现其包含GH18家族的特征氨基酸序列,获得了毕赤酵母转几丁质酶基因工程菌,表达的重组几丁质酶表观分子量44.4 ku,K_m=2.048 2 g/L,V_max=0.635 5×10³μmol/（L·min）,最适反应温度为50℃,最适pH值为5.0,在pH值为3.5时稳定性最高;金属离子Cu²⁺、Hg²⁺可强烈抑制酶活性;可抑制金黄壳囊孢菌等病原真菌的生长。研究结果为解析棘孢木霉几丁质酶在生防中的作用及功...     

毕赤酵母产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵优化及酶学性质研究

对毕赤酵母表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶条件进行优化,在摇瓶水平上研究了温度、pH、甲醇流加量、诱导时间,油酸等因素对重组葡聚糖酶的影响;得优化条件为:最适温度30℃、pH6.0,最佳甲醇诱导浓度为0.5%,最佳诱导时间为84h,酶活力达27.4U/mL,比初始酶活力提高了1.9倍。酶反应的最适pH为6.0,最适温度为50℃。在pH3.5～8.0的范围内和温度55℃以下保存时具有较好的稳定性;其中,CaCl2对重组酶的激活效果显著,使酶活力提高达92%。     

产几丁质酶细菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

采用胶体几丁质平板产生透明圈法,从竹林附近的土壤中分离得到一株高产几丁质酶的优良菌株,以胶体几丁质为反应底物,对其所产的几丁质酶粗酶性质进行了初步研究。结果表明,该酶最适p H 7.5,在p H 6.5~9.5的缓冲液中放置12 h后,残余酶活仍在60%以上,在p H 7.0~8.5的缓冲液中残余酶活仍在80%以上,说明该酶在中性和碱性条件下具有较好的稳定性;该酶在30℃时酶活最高,在低于60℃的处理条件下残余酶活仍在80%以上,且80℃处理后仍有37%的残余酶活,说明该酶的热稳定性较好;配制蟹壳培养基发酵该菌,发现该菌能直接降解蟹壳产生壳寡糖,且每克蟹壳降解后可产生5.3 mg还原糖。通过16S r DNA基因序列比对,鉴定该菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。     

哈茨木霉高产几丁质酶菌株的筛选及产酶条件研究

通过氮离子注入法诱变哈茨木霉(Trichoderma harzianum)野生菌,再以透明圈法对平板培养菌进行筛选,用DNS法测定液体培养菌的酶活,从中筛选出1株产几丁质酶能力高的哈茨木霉菌株H-13,并通过单因素试验和正交试验优化该目标菌株的发酵条件.单因素试验结果表明,添加1.0%蛋白胨时产酶量最高,1.0%胶体几丁质对菌体产几丁质酶的诱导性最强,初始pH 5.5、培养96 h时产酶量较高.正交试验表明,H-13以1.0%蛋白胨为氮源、0.5%胶体几丁质为碳源,在初始pH 5.0的培养基中培养96 h时,发酵液中的几丁质酶活可达到731.69 U?mL-1,比同样条件下的野生菌株酶活力提高1倍.     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

蝉拟青霉胞内几丁质酶、蛋白酶、溶菌酶研究

通过对8株蝉拟青霉Paecilomyces cicadae胞内几丁质酶、蛋白酶、溶菌酶的活力测定,从中筛选出酶活力高的菌株为GZDXIFR3716,并对3种酶的产酶条件进行了研究.结果表明,GZDXIFR3716产3种酶的最佳发酵培养基组成为葡萄糖20g·L-1、酵母膏5g·L-1、K2HPO41g·L-1;其几丁质酶、蛋白酶和溶菌酶含量最高的发酵时间分别为48h、60h和84h;而3种酶的最适反应温度分别为50℃、40℃和40℃;3种酶的最适反应pH值分别为6.0、7.0和5.0.     

溶解性多糖单加氧酶CBP21的高效分泌表达及与几丁质酶的协同作用研究

为实现溶解性多糖单加氧酶CBP21在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达,并对其与几丁质酶的协同作用进行研究,以大肠-枯草芽孢杆菌穿梭质粒p WB980为基本骨架,溶解性多糖单加氧酶为目的蛋白,构建了信号肽筛选载体,依据信号肽结构特征(正电荷与疏水性的差异)对Sec途径的13个信号肽进行了筛选,结果显示信号肽Ylq B引导分泌溶解性多糖单加氧酶的效率最高,其发酵液上清对胶体几丁质结合活力最高,上清中结合蛋白占总蛋白浓度为32.39%。进一步分别对CBP21和来自糖苷水解酶18家族粘质沙雷菌几丁质酶及来自糖苷水解酶19家族的嗜水气单胞菌几丁质酶Chi92的协同作用进行分析,表明CBP21对几丁质酶和Chi92活力均有促进作用,其中使粘质沙雷菌几丁质酶活力提高1.85倍,使Chi92(嗜水气单胞菌)活力提高2.35倍。上述研究为该溶解性多糖单加氧酶的工业应用奠定了基础。     

海洋放线菌F-1013对几丁质的利用及其发酵液的优化

研究了分离自海洋虾壳的一株放线菌F-1013对几丁质的利用及其发酵液的优化。结果表明:该菌具有较高的几丁酶活力。通过对该菌发酵液的筛选和优化,认为该菌在pH8-9、5%的虾壳粉培养液中发酵5-7d,甲壳低聚糖含量达到0.3mg.mL-1,产菌量优于其他基质的培养基。     

气单胞菌几丁质酶的产酶条件优化研究

[目的]为了进行气单胞菌几丁质酶产酶条件的研究。[方法]从自然死亡家蚕中肠围食膜中分离的气单胞菌进行产酶优化试验。其优化条件为:粉状几丁质1.2%,K2HPO4 0.12%,乙酸铵0.02%,发酵72 h,温度为30℃,起始pH值为8.0,培养基装量为15%。[结果]结果表明:该菌株所产几丁质酶的最适反应温度为25℃,pH值5.5,耐温性较差,但pH值5.0～9.0的酶活力较稳定(>88%)。[结论]该研究提供了提高几丁质酶产量的途径,但对该菌株进行基因改造或诱变育种,充分发掘其产酶潜力,对其几丁质酶基因进行克隆、表达等仍需进一步研究。     

Study on the character of chitinase produced by Trichoderna spp. with measuring reducing sugar

A trusty and intuitionistic method for screening chitinase produced by Trichoderma spp. was developed. 38 isolates of Trichoderma spp. were cultured in liquid medium with chitin or colloidal chitin as the sole carbon source for 4 days. The supernatant of the fermented broth was mixed with colloidal chitin and heated in water-bath at 37℃ for 30 min, then 3,5-dinitrosalicylic acid reagent (DNS) was added to the mixture, and let them react for 10 min in water-bath. According to the different colour of the mixture, the isolates of Trichoderma spp. which can produce chitinase could be screened.……     

淡紫拟青霉FZ-0289产几丁质酶的条件优化

通过单因素和多因素正交试验对淡紫拟青霉FZ0289产几丁质酶的条件进行了研究.单因素试验表明:100目几丁质粉末对菌体产几丁质酶的诱导性最强;添加蛋白胨能使产酶高峰提前,产酶量增加.多因素正交试验表明,在添加2g·L-1100目几丁质粉末、2g·L-1蛋白胨、1g·L-1KH2PO4、0.5g·L-1MgSO4、0.2g·L-1CaCl2和0.2g·L-1NaCl的培养基中接入经马铃薯蔗糖培养基(PSA)活化10d的菌碟(接菌孢子量为6×109个·L-1,500mL摇瓶中培养体积为150mL),在28℃、150r·min-1的条件下培养3d,发酵液中几丁质酶活达到0.11U·mL-1.     

爪哇正青霉Q-5产几丁质酶发酵条件的研究

通过单因素试验对爪哇正青霉Q-5产几丁质酶的条件进行了研究。结果表明:0.5%(w/v)几丁质粉末对爪哇正青霉Q-5产几丁质酶诱导性最强;pH值在5.0～7.0的范围内酶活力最稳定,pH值为4.0时,酶活力最低;金属离子Mn2+和Cu2+对爪哇正青霉Q-5产几丁质酶有明显的促进作用,而Fe3+和Ca2+则完全抑制几丁质酶的活性;以蛋白胨为氮源时,酶的活力最高可达24 U;吐温-80作为表面活性剂能显著提高几丁质酶活性。     

不同培养液和温度诱导球孢白僵菌BF菌株产酶特性的研究

分别采用Folin-酚法和DNS法对球孢白僵菌BF菌株在不同培养液、不同温度下产蛋白酶和几丁质酶的活性进行了研究。结果表明,白僵菌在3种不同的培养液中均能产生蛋白酶和几丁质酶。30℃以下时,以明胶培养液中产蛋白酶的活性最高（28℃时为127.09 U）;30℃以上时,以虫尸粉培养液产酶活性最高（35℃时为133.51 U）;球孢白僵菌在胶体几丁质中诱导几丁质酶的效果最好,其中30℃时酶活性最高（2.91 U）;其次为虫尸粉培养液,在28℃时酶活性最高（1.44 U）;细粉几丁质培养液的诱导效果在5个温度下都是最差;温度高于30℃时,这3种培养液诱导的几丁质酶活性都非常低。