应用半套式聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒S1基因的研究

根据离呼肠孤病毒S1133毒株S1基因序列，设计合成XZ11、XZ12和XZ11、XZ33两对引物，用半套式PCR对6株禽呼肠孤病毒标准毒株的核酸进行了检测。结果6株ARV均可扩增出和预期大小相符392bp的PCR产物，而对其他6种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性；该半套式PCR比RT-PCR更加敏感，这种方法可以检测出Ifg的ARV RNA模板。     

反转录聚合酶链反应和核酸探针检测禽呼肠孤病毒研究的概述

根据禽呼肠孤病毒(ARV)参考毒株S1133S1基因序列，设计合成4对引物而分别建立了RT-PCR、半套式PCR和一步法PCR三种用于检测ARV的方法。它们能检测到的最近ARVRNA量分别为1pg、1fg和0．16ngRNA；研制出禽呼肠孤病毒地高辛核酸探针，并建立了地高辛核酸探针检测ARV的方法，该核酸探针最低能检测到0．45ng的ARVRNA；对广西部分鸡场血清学调查表明，ARV平均阳性率为27％；对广西ARV野毒株进行了分离和鉴定，并对获得的2个地方分离株的S1基因片段进行测序及分析，两分离株与标准株S1133的同源性分别为98．5％和98．3％；用所建立的RT-PCR和地高辛核酸探针方法对用ARV人工感染鸡采集的各种样品的检测，并和传统病原分离方法进行比较，结果RT-PCR检出率为92．5％(222／240)，地高辛核酸探针检出率为74．2％(178／240)，病原分离鉴定方法检出率为55％(132／240)。用ARV强毒分别对免疫种鸡后代和无母源抗体或SPF的雏鸡进行攻毒试验，结果油苗免疫的种鸡后代对本病有很强的抵抗力，能抵抗ARV强毒的攻击，其平均保护率90．8％(109／120)。而无母源抗体或SPF的雏鸡攻毒后均100％(240／240)死亡。     

一步法RT-PCR快速检测禽呼肠孤病毒方法的建立及应用

根据禽呼肠孤病毒(ARV)P10基因保守序列设计了1对引物,建立了检测禽呼肠孤病毒的一步法反转录-聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对ARV扩增结果为阳性,参照毒株扩增结果均为阴性,对禽呼肠孤病毒检测的灵敏性为10pg总RNA。以上结果表明,该一步法RT-PCR特异性强敏感性高、简便和快速,可用于禽呼肠孤病毒病的早期确诊和病毒鉴定。     

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒

参考 Gen Bank中番鸭呼肠孤病毒 (m uscovy duck reovirus,MDRV ) S1基因序列 ,用计算机设计并合成了 1对引物 HP11、HP12 ,以此引物用 RT- PCR对番鸭呼肠孤病毒 S1基因进行了特异性扩增。结果表明 :引物 HP11、HP12能从所有供试的 4株分离毒 MDRV- MW9710、MW980 6、MW980 9、MW9810扩增出 30 0 bp S1基因 c DNA片段 ,而不能从禽呼肠孤病毒 (ARV) S1133株和番鸭胚成纤维 (MDEF)细胞培养物中扩增出任何片段 ;该 RT- PCR的检测灵敏度为 1pg的病毒核酸 ,特异性强 ,重复性好 ,对含毒细胞培养液和尿囊液只需用氯仿进行简单处理 ,即能检测出 MDRV核酸。因此认为 ,该 RT- PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒的快速检测     

鸡致病性大肠杆菌16S rRNA PCR鉴定方法的建立

为了建立一种鸡致病性大肠杆菌的快速检测方法,本试验通过无菌采集疑似感染致病性大肠杆菌鸡的心、肝、脾、肾作为病料,经过细菌分离培养、生化鉴定和致病力试验,利用大肠杆菌16S rRNA通用引物对3株致病菌进行PCR扩增,均得到了特异性扩增产物。并对扩增产物进行核酸测序和BLAST比对。结果显示,分离得到3株鸡致病性大肠杆菌(DZMG、DGCG1、DGCP3),扩增出的16S rRNA基因序列与鸡致病性大肠杆菌基因序列同源性为100%。提示该检测方法具有特异性高和简单快捷的特点。     

肉鸡禽呼肠孤病毒变异株的分离与致病性研究

为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况,了解其生物学特性及致病特点,对吉林省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR检测、序列分析及动物回归试验对该分离病毒进行鉴定。结果显示:成功分离到1株肉鸡ARV变异株,将其命名为ARV-JL21-0102;σC基因遗传演化分析显示:该分离病毒与ARV基因Ⅱ型参考株ISR528处于同一进化分支,氨基酸序列相似性为89.8%,而与ARV基因Ⅰ型疫苗株S1133和HeB02株氨基酸序列相似性分别为56.3%和58.4%;该变异株在LMH细胞上增殖良好,对鸡胚和1日龄SPF雏鸡存在一定的致病性;与基因Ⅰ型HeB02株相比,变异株对鸡胚和SPF雏鸡致病性较弱,感染雏鸡发病时间推迟,雏鸡致死率较低。研究结果为全面了解ARV变异株的遗传进化特征和新型疫苗的研发奠定了基础。     

应用RT-PCR技术诊断鸡传染性支气管炎

根据已发表的IBV4／91 attenuated株S1基因序列，设计并合成了产物约600bp的IBV特异性PCR引物对。从可疑病鸡气管、肺脏或肾脏组织中提取总RNA，用AMV反转录酶反转录后，再进行PCR扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小。采用NDV和IBDV病料组织作阴性对照，IBV标准株M41作阳性对照。该法检测特异性强、成本低、检出率高，可有效用于鸡传染性支气管炎的早期检测和流行病学研究。     

RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立与应用

建立RT PCR检测猪瘟病毒的方法。根据已发表的猪瘟病毒E2基因 (囊膜糖蛋白gP55基因 )序列 ,设计合成了一对特异性引物 ,扩增片段的大小为 50 7bp ,用RT PCR技术对石门系标准株和 1 0株分离株进行检测。结果这对引物对标准株和 1 0株分离株均能扩增出与预期大小相符 50 7bpRT PCR产物 ,而对其他 6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该RT PCR可检出 1 0 0pg的猪瘟病毒RNA模板 ,对人工感染猪不同组织样品进行检测 ,结果对白细胞抽提的核酸样品检出率最高为 1 0 0 % (2 4 / 2 4 ) ,其次为扁桃体、脾、肾 ,检出率为 83 3 % (2 0 / 2 4 ) ,再者为淋巴结 ,检出率为66 7% (1 6/ 2 4 )。对送检的 1 9份疑似猪瘟的病死猪病料组织进行RT PCR检测 ,结果有 1 6份样品为猪瘟病毒阳性。兔体交叉反应试验结果RT PCR阳性的 1 6份病料中 ,有 1 4份样品被判为含有猪瘟病毒 ,其他病料兔体交叉反应试验结果全为阴性     

贵州省某绿壳蛋鸡养殖场常见疫病感染情况监测分析

为了探明2017年贵州省某绿壳蛋鸡养殖场主要疫病的感染情况,试验从发病鸡场采集11只发病鸡组织器官和30份临床健康鸡血清样品,应用ELISA方法对30份临床健康鸡血清样品进行禽白血病病毒(ALV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)和禽败血支原体(MG)抗体检测,应用RT-PCR方法检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)和禽白血病病毒(ALV),应用PCR方法检测安卡拉病毒(FAV-4)、马立克氏病病毒(MDV)和MG,并对发病鸡肝脏组织样品进行细菌分离培养,用16S RNA引物对分离菌进行PCR扩增,对扩增产物进行测序及比对,最后通过药敏纸片法对分离菌进行药敏试验。结果表明:在发病鸡场中,ALV、ARV、AEV和MG的抗体阳性检出率分别为40.00%(12/30)、83.33%(25/30)、80.00%(24/30)和53.33%(16/30);ALV和MDV的病原核酸检出率都较高,分别为100%(11/11)和81.82%(9/11),而IBV、NDV、AIV、FAV-4和MG均未能检出病原核酸;从发病鸡肝脏组织中均分离得到1株革兰氏阴性杆菌,经序列比对证实该分离菌为沙门氏杆菌;分离菌对硫酸新霉素和硫酸安普霉素极度敏感,对磷酸替米考星、林可霉素、延胡索酸泰妙菌素和硫酸黏杆菌素高度敏感,对盐酸多西环素中度敏感,对磺胺间甲氧嘧啶钠和酒石酸泰乐菌素低度敏感,对酶法阿莫西林不敏感。     

一例禽呼肠孤病毒和滑液囊支原体混合感染的实验室诊断

2013年3月,江苏省宝应县某蛋鸡场饲养的一批5 000羽海蓝褐商品代蛋鸡从170日龄开始部分鸡陆续发生关节炎,部分病鸡肝脏还可见白色坏死点,累计发病率超过30％.无菌采集发病鸡肝脏和关节腔积液,分别用麦康凯琼脂平板和血平板进行细菌分离,结果均为阴性.根据禽呼肠孤病毒（ARV） σB基因和滑液囊支原体（MS） vlhA基因分别设计引物用于两种病原体的PCR检测,结果显示,以病鸡肝脏组织和关节腔积液提取的RNA样品为模板,通过RT-PCR均可扩增出约900 bp大小的ARV特异性条带,以关节腔积液提取的DNA样品为模板,通过PCR亦可扩增出200 bp大小的MS特异性条带,结合流行病学特征,可以将该鸡场暴发的疾病确诊为禽呼肠孤病毒和滑液囊支原体混合感染.     

禽呼肠病毒套式RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽呼肠病毒(ARV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为247 bp,建立了适合ARV快速检测的套式RT-PCR方法(RT-nested-PCR).采用该方法对REV毒株进行了检测,均能扩增到247 bp的条带,而禽流感病毒(H9亚型)...     

用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的研究

本文报告了建立反转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）检测禽呼肠孤病毒（ Ａ Ｒ Ｖ）的方法,根据禽呼肠孤病毒 Ｓ１１３３ 毒株 Ｓ１ 基因序列,设计合成两对引物,用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术对 ６ 株禽呼肠孤病毒国际标准株进进行了检测。结果两对引物对 ６ 株 Ａ Ｒ Ｖ 均可扩增出与预期大小相符 ５３２ｂｐ 和 ４３５ｂｐ 的 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 产物,而对其它 ６ 种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性;该 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 可以检测出 １ｐｇ 的 Ａ Ｒ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 模板。     

ARV、REV与ALV三重RT-PCR检测方法的建立

根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术。结果表明,用这3对引物对同一样品中的ARV、REV、ALV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,可同时扩增ARV的247bp,ALV的675bp,REV的467bp的特异性片段,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。用42份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为92%以上。表明建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

禽呼肠孤病毒与禽白血病病毒双重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中禽呼肠孤病毒(ARV)、禽白血病病毒(ALV)基因序列,设计2对引物,在建立鉴别各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立2种病毒的双重RT-PCR。对同一样品中的ARV、ALV核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增ARV 485 bp、ALV 673 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的ARV模板。用31份临床病料对本研究双重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这2种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

禽呼肠孤病毒RT—LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽呼肠孤病毒（Aviem reovirus,ARV）S1基因序列设计了特异对应靶序列中的6个基因区段的4条引物,以此建立了一种快速、准确的ARV逆转录环介导等温扩增（RT—LAMP）检测方法,并对此方法的反应条件进行了优化。结果表明,该方法能够特异地扩增ARV,而对其他常见的禽类病毒均无扩增作用,特异性强、重复性好;检测ARV的灵敏度为4ELD50,是RT-PCR方法的10倍;在反应产物中添加SYBR GREEN Ⅰ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。     

禽四种病毒多重PCR诊断技术的建立和应用

根据禽呼肠孤病毒（ARV）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的基因保守区设计了4对特异性引物,建立了针对四种病毒的多重PCR检测体系,并对该体系进行了条件优化及特异性、敏感性试验。该体系扩增的四种病毒基因片断大小分别为199bp（ARV）、264bp（AIV）、362bp（NDV）和459bp（IBV）,且特异性、敏感性良好,能够检出1pgAIV和10PgARV、NDV、IBV的RNA。临床应用结果证明,该体系具有很高的实用价值和应用前景。     

番鸭呼肠孤病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank上发表的鸭呼肠孤病毒基因组序列,利用生物学软件设计合成内外2对引物,建立了检测番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的套式RT-PCR检测方法,并运用建立的检测方法对分离病毒与其他禽病病毒进行检测。结果显示,该方法能从MDRV中扩增到与预期大小相符的特异性目的片段,检测灵敏度达到0.1 pg病毒RNA,对禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)、鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)、鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV)等病毒样品的扩增结果均为阴性。因此,本研究为番鸭呼肠孤病毒病的快速检测及诊断研究提供参考。