猪粪便中致病性病原菌检测与耐药性分析

为了检测猪粪便中的致病微生物并分析其耐药性,试验采用细菌分离培养、生化试验、16S rRNA PCR检测与测序、致病性试验等方法对从镇江地区不同养猪场采集的100份粪便样品进行病原菌鉴定,采用K-B药敏纸片法测定致病性病原菌的耐药性。结果表明:从100份粪便样品中分离得到大肠杆菌25株、沙门氏菌17株、金黄色葡萄球菌15株,其中致病性大肠杆菌20株,致病性沙门氏菌15株,致病性金黄色葡萄球菌10株;分离菌16S rRNA PCR扩增得到大小约为1 492 bp的目的条带;57株分离株的PCR产物测序结果与GenBank中参考株基因序列的同源性高于97.0%;致病性大肠杆菌对阿莫西林、环丙沙星、磺胺间甲氧嘧啶等12种药物的耐药率在65.0%～95.0%之间,致病性沙门氏菌对阿莫西林、氟苯尼考、庆大霉素等12种药物的耐药率在46.7%～100%之间,致病性金黄色葡萄球菌对阿莫西林、庆大霉素、氟苯尼考等9种药物的耐药率在50.0%～100%之间,且存在多重耐药性。     

鸡源大肠杆菌AmpC型β-内酰胺酶的分子检测

为了解河南地区AmpC型β-内酰胺酶耐药基因在产16S rRNA甲基化酶鸡大肠杆菌的流行与分布,分别设计特异性引物对2005—2008年在河南地区病鸡的病料中分离保存的158株16S rRNA甲基化酶阳性鸡大肠杆菌进行聚合酶链式反应扩增。检测结果显示,在158株产16S rRNA甲基化酶鸡大肠杆菌中,CMY-2和DHA-1检出率分别为34.8%和36.1%。提示AmpC型β-内酰胺酶耐药基因在河南地区产16S rRNA甲基化酶鸡大肠杆菌中普遍存在。      

辽西地区致病性鸡大肠杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

为了解辽西地区致病性鸡大肠杆菌(E.coli)的流行情况,以明确该地区大肠杆菌16S核糖体核苷酸(ribosomal RNA,rRNA)基因序列变异特点,试验采用细菌分离纯化培养技术、生化鉴定技术及16S rRNA基因序列分析技术对从辽西地区不同规模养鸡场采集的12份病料中分离出的10株革兰氏阴性小杆菌进行了研究。结果表明:所分离出的阴性小杆菌被初步判定为大肠杆菌,这10株采集自不同鸡场的大肠杆菌16S rRNA核苷酸基因序列中有4株血清型为O_(78),余下6株中2株与O_(78)同源性最高,2株与O_2同源性最高,2株与O_(111)同源性最高,各株大肠杆菌碱基突变位点一致。说明辽西不同地域的致病性大肠杆菌血清型近半数为O_(78),故O_(78)可能为主要流行株。     

红腹锦鸡大肠杆菌病的细菌学诊断

无菌采集病死红腹锦鸡肝脏、脾脏和心血,接种多种培养基分离细菌。以生化试验和小鼠攻毒试验,鉴定分离细菌及其致病性。采用PCR方法扩增分离细菌16S rRNA,测定核苷酸序列,与GenBank中大肠杆菌相应基因序列进行分析比较,绘制系统进化树。结果表明,分离细菌为大肠杆菌,可以致小鼠死亡。其16S rRNA基因序列与GenBank登录的大肠杆菌相应基因同源性超过99%。由此证明,该红腹锦鸡死于大肠杆菌病。     

新疆某牛场大肠杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

为了调查新疆某规模化奶牛场犊牛腹泻的原因并确定病原,无菌采集15份腹泻犊牛粪样进行病原的分离培养,采用形态学观察、生化试验、血清学和致病性分析等方法鉴定分离菌株,利用大肠杆菌16S rRNA通用引物进行基因序列扩增并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的其他菌株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树并进行分析,同时对分离菌株的黏附性基因进行鉴定。结果从15份样品中分离获得2株分离菌株;试验显示,分离株均发酵葡萄糖,MR试验、吲哚和甲基红试验呈阳性,硫化氢、氧化酶、DNA酶、VP试验呈阴性。2株分离菌株血清型均为O78,且均具有致病性。药敏试验显示,分离菌株均对环丙沙星、卡那霉素、氟哌酸、庆大霉素、磺胺甲唑、头孢哌酮、壮观霉素、多黏菌素B、呋喃妥因敏感。分离株16S rRNA基因序列与大肠杆菌菌株NF738(GenBank登录号:MT649856)同源性为≥99.7%,且处于同一大分支。经PCR鉴定,分离菌株具有K88黏附性基因。本研究结果证实了引起新疆某规模化奶牛场犊牛腹泻的病原为致病性产肠毒素型大肠杆菌。     

华南虎源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

从患病华南虎分离病原菌,进行快速鉴定,同时以大肠杆菌16S rRNA基因的通用引物和irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR扩增、测序,并将扩增出来的irp2、iucD、iss基因序列与Genbank相应序列进行同源性分析。测序鉴定为大肠埃希氏菌,与传统细菌鉴定方法结果相一致,分离菌携带irp2、iucD、iss毒力基因,从毒力试验得到证实。其序列与Genbank上发表的iucD、iss基因序列同源性分别高达98%、99%,而irp2基因序列的同源性仅为48%。采用16S rRNA基因序列分析法可以对华南虎大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,华南虎源性大肠杆菌同时携带有irp2、iucD、iss 3个毒力基因,可能与其致病性有关系。     

猪丹毒丝菌PCR检测方法的建立

根据Genbank中猪丹毒丝菌的16S rRNA基因序列的差异设计特异性引物,对6株临床分离的丹毒丝菌菌株进行PCR扩增.结果显示,此引物对6株丹毒丝茵均扩增出与预期大小472 bp相一致的片段,而对多杀性巴氏杆茵、大肠杆菌等10种病原体的扩增结果均为阴性;PCR敏感性试验结果表明,该方法可以检测到186 CFU/μL...     

一株较强致病性鸡大肠杆菌的分离与防控

从某鸡场病死鸡的肺、肝、脾脏3种器官分离出一株病原菌,经过16S rRNA扩增测序及生理生化检测,确定为大肠杆菌.后续经药敏试验、益生菌抑制试验及动物感染、防治试验,结果表明,该大肠杆菌具有较强的感染能力,致病性强,且对新霉素、庆大霉素、四环素等7种常见抗生素具有耐受性,但能被植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等乳酸...     

奶牛乳房炎无乳链球菌的分离及PCR鉴定

利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体培养基和色素试验培养基选择培养无乳链球菌,参照GenBank中无乳链球菌参考菌株(Accession:AF015927.1、JQ289582.1)16SrRNA和种属特异性基因cfb(CAMP因子)序列设计引物,对奶样中分离的12株疑似无乳链球菌进行鉴定。结果显示,经PCR扩增后,被检测的12株细菌均可扩增出预期大小的16S rRNA基因序列,而12株中有8株可以扩增出预期大小的cfb基因序列,条带单一,特异性好。序列BLAST显示,12株菌的16S rRNA基因序列与NCBI上报道的无乳链球菌相应序列高度同源(>99.0%),各分离菌株间的16S rRNA基因序列也高度同源(99.0%～100.0%);cfb基因序列与NCBI上已报道的无乳链球菌相应序列具有高度同源性(>99.0%),各菌株间cfb基因序列也高度同源(100.0%)。经选择培养与PCR鉴定结果可以确定12株疑似菌株中有8株为无乳链球菌。     

流产奶牛胎儿肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

从流产奶牛胎儿组织中分离到1株革兰氏阴性短杆菌,采用细菌分离纯化、生化试验、16S rRNA和16S～23S rRNA测序、药敏试验和小鼠致死性试验对其进行了鉴定。结果显示,该分离菌与GenBank中肺炎克雷伯氏菌16S rRNA和16S～23S rRNA基因序列一致性分别高达99%和96%,16S～23S rRNA基因被扩增出3条不同长度条带;该菌生化特性均符合肺炎克雷伯氏菌的生化反应特性;对头孢曲松、阿米卡星、多粘菌素等敏感,对多西环素、四环素、卡拉霉素等中度敏感,对青霉素、红霉素、米诺环素等耐药;对小鼠有很强的致病性。以上结果表明,该分离细菌为肺炎克雷伯氏菌。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用

根据GenBank登录的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1~14型的表面抗原蛋白D15和16S rRNA基因序列,设计2对特异性引物,分别扩增出637、431 bp两条核苷酸片段,建立了APP的多重PCR检测方法。特异性结果表明,血清1、3、5a、8、10型能扩增出两条与预期大小的片段,而扩增的大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌均成阴性。敏感性试验结果表明,最低检出浓度为50/μL。对临床分离的5株疑似APP菌株进行PCR,结果表明,其中4株为阳性,1株为阴性。提示,该方法的特异性和敏感性均良好。     

应用PCR快速检测鸡滑液囊支原体的研究

根据鸡滑液囊支原体(MS)16S rRNA设计引物,对1株MS阳性株、5株临床分离鉴定的MS、2株鸡毒支原体、1株多杀性巴氏杆菌、1株沙门菌、1株大肠杆菌和1株金黄色葡萄球菌进行PCR扩增,结果显示所有MS均出现1 077 bp特异性扩增条带,其余非MS则均未扩增出特异性条带。敏感性测定结果表明,优化的PCR反应体系能检出MS的最低DNA量为1 pg。建立的PCR方法用于快速检测临床样品检测,对鸡肿胀跗关节腔内容物直接进行PCR检测,检出率为21.1%(32/152),显著高于病原分离方法的9.2%(14/152),具有良好的实际应用意义。     

框镜鲤致病性维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测框镜鲤致病性维氏气单胞菌(A.veronii)双重PCR方法,本研究以A.veronii CY0806株和国际标准株DNA为模板,分别以16S rRNA和Aer基因特异性引物进行PCR扩增,分别获得大小约880 bp和430 bp的DNA片段。通过序列比对分析,16S rRNA基因片段、Aer片段序列与GenBank中登录的A.veronii ATCC35624株的的同源性均为99%。进一步试验显示该方法的敏感性较高,达到1.58×10-3ng/μL,特异性较强,只有A.veronii标准株及分离株结果呈阳性;人工模拟污染样本试验显示:该方法的检出率达到了86.7%,高于细菌分离培养的70%检出率。双重PCR检测方法的建立,为框镜鲤致病性A.veronii的检测提供新的方法。     

雏鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定和荚膜PCR分型

本研究从河南某肉鸭养殖场感染鸭肝炎病毒的10日龄病死鸭肝脏中分离到一株致病菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应、致病性回归试验和SPF鸡攻毒试验,结合多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm) kmt1种特异性基因检测方法进行鉴定,并通过16S rRNA序列测定进行同源性分析.结果显示该分离株为Pm,命名为Pm-Y.致病性回归试验表明低浓度的Pm-Y只引起部分10日龄雏鸭发病死亡.SPF鸡攻毒试验显示,Pm-Y与国内标准强毒株C48-1的致病力相近,16S rRNA序列系统发育树分析表明Pm-Y与Pm多杀亚种和杀禽亚种亲缘关系最近.参考荚膜血清特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD合成引物,扩增荚膜血清型特异性基因,对Pm-Y进行荚膜分型鉴定为A型Pm.本研究是国内首例从感染鸭肝炎病毒10日龄雏鸭肝脏中分离到Pm的报道.     

黑颈鹤源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

对黑颈鹤病原菌进行快速鉴定及毒力因子分析。采用16S rRNA序列分析法鉴定黑颈鹤病原菌,其毒力基因分别用大肠杆菌的irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR检测,并将扩增出来的irp2基因序列与Genbank~（TM）相应序列进行同源性分析。分离菌株鉴定为大肠埃希氏菌,鉴定结果与生化检测结果一致,分离菌携带irp2毒力基因,这从毒力试验得到证实,其序列与与Genbank~（TM）上发表的HPI irp2基因序列同源性高达98%以上。采用16S rRNA序列分析法可以对黑颈鹤大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,黑颈鹤源性大肠杆菌携带有irp2毒力基因。     

禽源鲍曼不动杆菌的分离鉴定和系统发育分析

为了确定河南某养鸡场鸡只发生细菌性感染死亡的病原,试验对发病蛋鸡的肝脏和脾脏进行细菌分离,并对疑似病原菌进行形态特征、培养特性的观察,以及生化试验、药敏试验、小鼠致病性试验、特异性基因检测、16S rRNA基因序列分析并构建遗传进化树。结果表明:该分离菌是鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii),对阿米卡星等抗生素敏感,且对小鼠有较强的致病性,LD50达到1.4×108cfu/mL;16S rRNA基因序列与鲍曼不动杆菌的同源性达到99.9%,与不动杆菌属其他种的同源性为95.9%~97.9%;遗传进化树分析显示,其与人源的北京参考菌株ZW85-1的亲缘关系最近。     

1株山鸡源致病性大肠杆菌的分离鉴定

为查明秦皇岛市某山鸡养殖场山鸡大批量死亡病因,试验对分离到的致病优势菌株进行生化鉴定和16S rRNA基因序列分析,并测试分离菌对21种抗生素的敏感性,进一步采用PCR方法检测分离菌的耐药基因。利用清洁级昆明小鼠和SPF鸡胚分别对分离菌进行致病性试验,并采用PCR方法检测分离菌的毒力基因。结果显示：分离菌为革兰氏阴性杆菌,在伊红美蓝培养基上生长出有金属光泽的菌落,生化特性与大肠杆菌生化特性符合率高达99%。BLAST分析发现,分离菌16S rRNA序列与大肠杆菌的基因相似性高达99.8%。分离菌对恩诺沙星和阿米卡星高度敏感,对青霉素、头孢曲松等15种药物耐药。分离菌的磺胺类、β-内酰胺类、四环素类的耐药基因与耐药表型基本相符,其余耐药基因与耐药表型不符,提示该分离菌可能存在其他的耐药机制。致病性试验结果显示,分离菌具有较强致病性,共检测到12种大肠杆菌主要毒力基因。研究表明,分离菌为山鸡源致病性大肠杆菌,且耐药情况复杂,具有较强的毒力和致病性。     

猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析

为了鉴定青岛地区3个猪场病死猪的致病菌,试验采用形态学观察、生化试验、16S rRNA PCR鉴定、血清型鉴定、毒力因子基因表型检测及药敏试验等方法对分离得到的3株细菌进行研究。结果表明:这3株细菌均为革兰氏阳性链状球菌,生化特性与猪链球菌的生化特征大致相符;16S rRNA PCR产物测序结果证实3株细菌均为猪链球菌;用猪链球菌1,2,7,9型特异性引物进行PCR扩增,3株细菌均为猪2型链球菌,其中有2株细菌的毒力因子基因表型为Mrp+Epf+Sly+,1株细菌毒力因子基因表型为Mrp-Epf+Sly+;3株细菌对大部分β内酰胺类、氟喹诺酮类抗生素敏感,对多肽类、林可胺类抗生素耐药。说明猪场分离得到的3株细菌均为2型猪链球菌,可选用β内酰胺类、氟喹诺酮类抗生素进行治疗。     

禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用

为了解临床禽源致病性大肠杆菌中高致病性毒力岛(High pathogenicity island HPI)流行情况和基因特征,根据Gen Bank已知禽源irp2基因序列,设计、合成一对特异性引物,建立irp2基因PCR检测方法,优化、确定PCR扩增特性,进行敏感性、特异性、重复性检测评价。对256份临床分离禽源大肠杆菌进行irp2基因PCR检测和基因遗传变异分析。结果显示,建立的PCR检测方法敏感性可达2.14×10~(-4)ng/μL;特异性显示与鸡沙门菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸均无交叉反应;重复性显示3份阳性样品重复5次检测,变异系数3.4%~5.0%。256份临床样品PCR检测irp2基因,阳性率30.6%。获得了9株分离株irp2基因序列,分析显示,与GenBank已知基因同源性高达96.2%以上。说明建立的禽源大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床致病性大肠杆菌毒力岛基因快速检测。     

牦牛源鲍曼不动杆菌的分离及鉴定

本试验从患肺炎的牦牛细支气管中分离得到一株致病细菌"SWUN6759",用PCR扩增其16S rRNA序列进行鉴定,并作同源性比对、系统进化分析,以及药物敏感及致病性检测。结果显示:SWUN6759为鲍曼不动杆菌,它与鲷源、鸡源、水蜡虫源、人源、牛源鲍曼不动杆菌的核苷酸序列的同源性均低于50%,说明SWUN6759具有种属特异性;耐药性结果显示其仅对多西环素、氧氟沙星、环丙沙星敏感,致病性试验结果显示其对小鼠具有较强的致病作用。