基于M基因的新城疫病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对临床样品中新城疫病毒检测的研究

根据新城疫病毒M基因的保守序列,设计合成1对引物和TaqMan探针,以作者实验室构建并保存的鹅源新城疫病毒zJ1株M基因阳性重组质粒为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,结合ABI公司的7300型荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测新城疫病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法.该方法在106～101拷贝范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中3拷贝·μL-1的病毒核酸,与传统的病毒分离方法具有相近的敏感性,二者对500份临床禽泄殖腔棉拭样品检测结果阳性数、阴性数符合率分别为90.0%、99.8%.经临床应用表明:荧光定量PCR的建立为早期诊断禽新城疫病毒、定量分析禽新城疫病毒感染程度奠定了基础.     

强、弱毒力新城疫病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

通过比对新城疫病毒强、弱毒株F基因序列,根据其在F0裂解位点的差异以及F基因保守序列设计合成NDV-V-probe和NDV-L-probe探针组和NDV-F、NDV-R引物组,以基因Ⅶ型NA-1株和基因Ⅱ型LaSota疫苗株病毒RNA作为定量检测的标准品,建立检测方法。对所建立的标准曲线进行分析,相关系数R2均为0.997,线性关系良好。通过计算变异系数CV/%分别为0.034%和0.027%,均小于1%,说明稳定性良好。对禽类常见病毒IBV、H9亚型AIV检测未发现有交叉反应,特异性好、重复性佳。结果表明:成功建立了新城疫病毒强、弱毒双重荧光定量RT-PCR的检测方法,实现了从分子水平上快速鉴别强、弱毒力的新城疫病毒,也可快速区分野毒感染动物和疫苗接种动物,减少不必要的经济损失。     

禽肉产品中禽流感与新城疫多重PCR-DHPLC检测方法的建立

应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感和新城疫,其PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测分析后,检测极限分别达10-0.5ELD50/0.1mL和10-1.5ELD50/0.1mL。与普通凝胶电泳比较,敏感性高2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR-DHPLC仅检测到禽流感病毒与新城疫病毒,而对其他5种禽类病原体和SPF鸡胚尿囊液均未检测到阳性吸收峰。所建立的方法检测不同亚型禽流感病毒29株、不同来源及不同毒力的新城疫病毒16株,结果与实时荧光定量PCR检测结果完全一致;与病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,两种方法检测禽流感的符合率为94.4%(34/36),检测新城疫的符合率为95.4%(21/22)。病原分离法的检出率虽高于DHPLC方法,但经统计学分析两者差异不显著,两种方法同时对27份进口鸡胗样品与90份棉拭子样品进行检测,阴性符合率为100%,可适用于进出口禽肉产品的检测。     

荧光RT-PCR检测活禽和禽产品中新城疫病毒中强毒株的研究

本研究中，采用TaqMan方法，根据新城疫病毒F基因核苷酸序列，设计合成多对引物，在上游引物和下游引物之间设计多条探针，通过对引物、探针的筛选，反应条件的选择和优化，建立了检测活禽和禽产品中中强毒力新城疫病毒的荧光RT-PCR方法。经对10株倍比稀释的中强毒力新城疫病毒的尿囊液进行检测后，表明所建立的荧光RT-PCR方法的检测极限在10^-5～10^-7”之间，略低于鸡胚病毒分离方法（10^-8～10^-9）；对收集到的所有新城疫病毒株和常见禽类病毒（包括禽流感病毒H5、H9亚型、IBDV、IBV、KIBV、CAAV、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒）进行检测，结果表明建立的方法不能检出其他的常见禽类病毒，特异性良好。进一步用建立的荧光RT-PCR检测人工感染SPF肉鸡的组织脏器、咽喉及泄殖腔拭子及临床样品中的中强毒力的新城疫病毒，并同鸡胚分离结果比较，结果表明荧光RT-PCR的敏感性同鸡胚分离试验基本一致。由于荧光RT-PCR方法快速，从处理样品开始到出结果只需不到4小时，而且检测样品量大，这就充分显示了其快速、敏感、特异的优势。在强调口岸快速通关的今天，该方法的建立无疑为活禽或禽产品的快速检验检疫提供了有效的手段。     

荧光定量RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒方法的建立与验证

根据H5亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以H5亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品绘制标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.995,灵敏度约为8拷贝/μL,相当于8个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为H5亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、低成本、高通量、生物安全性好的定量检测方法。对178份临床泄殖腔棉拭子样品的检测,该方法结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%,在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示了良好的应用前景。     

H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据H9亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以阳性H9亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明:本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度约为6拷贝/μL,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好,重复性佳,对193份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%。该方法为H9亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、较便宜、高通量、生物安全性好的定量检测手段,将在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

基因VI型新城疫病毒反转录数字PCR检测方法的建立与应用

基因VI型新城疫病毒（NDV）是导致我国当前鸽新城疫流行的主要基因型。国家新城疫参考实验室监测数据表明，鸽NDV分离率近年来有上升趋势。为了实现基因VI型NDV快速检测和精确定量，针对国内流行的基因VI型NDV F基因保守区域设计特异性引物和探针，建立了反转录数字PCR（RT-dPCR）方法，并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示，建立的RT-dPCR方法线性关系良好，灵敏度高，最低检测限为1.97 copies/μL；特异性强，与其他基因型NDV强毒株和常见禽病病毒无交叉反应；重复性好，变异系数为2.2%。利用本方法对临床采集的180份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测，检测结果与病毒分离结果一致。以上结果表明，本研究建立的RT-dPCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好，可用于基因VI型NDV的快速检测和精准定量，同时也为基因VI型NDV核酸标准物质研制奠定了基础。     

实时荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病毒

根据禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)M基因上的保守序列,合成引物和荧光标记探针,以阳性AIVM基因质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应(RRT-PCR)检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为5拷贝/μL,相当于5个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为AIV检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。对500份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果阳性?阴性数与经典病毒分离方法符合率分别为91.2%?99.4%。在AIV临床样品筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

快速诊断鸽瘟方法的研究

从疑似鸽瘟的6例临床病例中分离到5株鸽Ⅰ型副黏病毒（SCP1-SCP5），经本实验室建立的检测中、强毒力新城疫（NDV）病毒的SYBR GREENⅠRT—PCR（RRT—PCR）方法诊断，确诊为中、强毒力新城疫毒感染，用常规RT—PCR扩增SCP1包括F蛋白裂解位点的基因片段，并进行克隆、序列测定。分析表明，SCP1编码F蛋白的基因片段裂解位点处的序列为^112K-R-^114Q—K—R-^117F，与新城疫强毒在这一区域的序列相符；与21株已报道的NDV进行核苷酸同源性比较，并建立进化树，聚类为基因Ⅵ型。     

基因VI型新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

鸽新城疫是严重危害鸽业健康发展的主要疫病之一,近年来流行呈上升趋势。为满足开展基因VI型鸽源新城疫病毒快速检测的迫切需求,针对国内流行的基因VI型新城疫病毒F基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了一种可特异检测基因VI型新城疫病毒的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性进行了评估。结果显示,该方法与其他基因型新城疫病毒和常见禽病病毒无交叉反应,检测下限为5 copies/μL。利用该方法对临床采集的120份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,检测结果与病毒分离结果完全一致。结果表明,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法特异性强、敏感性高、准确性好,可用于基因VI型新城疫病毒的快速检测。     

新城疫病毒通用型实时RT-PCR检测方法的建立与应用

采用TaqMan方法,经引物和探针的设计、筛选及反应条件优化,研究了检测活禽和禽产品中新城疫病毒的通用型实时RT-PCR(RRT-PCR)方法。结果显示,对12株分别为速发型、中发型、缓发型和疫苗株新城疫病毒的尿囊液倍比稀释液的检测极限在10-5~10-7之间;建立的方法与常见禽类病毒无交叉反应,特异性良好;在检测人工感染肉鸡的脏器组织、咽喉、泄殖腔拭子中病毒的灵敏度同鸡胚分离试验基本一致;弱毒疫苗免疫鸡群在免疫后14 d,应用本方法不能从咽喉、泄殖腔拭子中检测到病毒;临床样品检测表明,该方法不仅可以检出中强毒力新城疫毒株,也可检出缓发型野毒株和疫苗毒株。     

鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

江西省宜春地区鸡新城疫流行情况调查

为了解江西省宜春地区鸡新城疫（ND）流行情况,在2016年3月—2017年3月对宜春地区樟树、丰城、高安、宜春、万载5个重点养鸡县（市）的31个鸡场的疑似患有ND的鸡群进行现场问询、跟踪调查。结果发现,鸡新城疫在宜春地区一年四季均有流行,其中冬季发生该病的频率相对高些,其次为春季,夏、秋季发生该病的频率相对低些;发病鸡只的日龄无差异性,各阶段的鸡只均可发生;整体发病率为20.1%-30.8%,死亡率为9.0%-25.4%,产蛋下降率为15.3%-38.8%。同时,利用SPF鸡胚对来自宜春地区5个县（市）的31个鸡场的214份病料进行新城疫病毒（NDV）分离,共分离到27株具有血凝性的病毒,经过血凝试验（HA）、血凝抑制试验（HI）及血清中和试验,最终确定23株为NDV。其中,除了2株毒力不能确定之外,其余21株均为NDV强毒株。将21株病毒用30日龄非免疫鸡进行攻毒试验,发病率为80%~100%,死亡率为60%~100%,发病鸡只均出现鸡新城疫感染的典型症状及病变。     

鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank中已登录的鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）的基因序列,设计了3对特异性引物,建立了DHV、AIV和NDV的多重PCR鉴别诊断技术,并对体系进行了优化和特异性、敏感性试验。结果表明,该体系所扩增的3种病毒基因片段大小分别为174bp（DHV）、264bp（AIV）和362bp（NDV）,且特异性、敏感性良好,能够分别检出1pg AIV、10pg DHV和10pg NDV的病毒RNA。对鸭临床样品的检测结果表明,该方法与病毒分离鉴定符合率90%以上,可用于临床样品的快速检测。     

Differential detection of Newcastle disease virus strains by degenerate primers based RT-PCR

Degenerate primers based RT-PCR (previously described by [Avian Dis 26 (1997) 837]) has been used for the detection and differentiation of Newcastle disease (ND) viruses. Two sets of primers (A+B and A+C), with common forward primer and distinct reverse degenerate primers, designed from fusion protein gene encoding for cleavage site, could differentiate virulent and avirulent Newcastle disease viruses (NDV). Both sets of primers amplified "F" gene sequence of virulent (velogenic and mesogenic) viruses, whereas in avirulent strains, amplification was only with primer set A+C. Total 10 NDV isolates and two clinical samples including both known and unknown pathotypes, were checked. Based on amplification results 5 viruses were found to be virulent type and 6 as avirulent with one of the two clinical samples, earlier positive by RT-PCR using non-degenerate "F" gene specific primers was found negative in this study. The technique has been found to be a simple and quick for the detection and differentiation of virulent and avirulent NDV, which is important for control of the disease in the events of the outbreaks.     

同时检测禽流感和新城疫病毒的一步法荧光定量RT—PCR方法的建立

分别根据新城疫病毒与禽流感病毒的M基因、禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计了通用型禽流感病毒、H5＼H7＼H9亚型及通用型新城疫病毒5对特异性引物和5条Taqman荧光标记核酸探针。以阳性重组质粒进行体外转录后的RNA为标准品绘制标准曲线,建立了一步实时荧光RTPCR方法。结果表明,本试验建立的标准曲线Ct值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数大于0．99。通过利用所建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的临床样品进行检测,2种方法的检测结果符合率为100％,说明在临床样品检测、流行病学监测方面具有良好的应用前景。     

Rapid detection and differentiation of Newcastle disease virus isolates by a triple one-step RT-PCR

A triple one-step RT-PCR was developed to screen and differentiate virulent from avirulent Newcastle disease virus (NDV) isolates. Three sets of oligonucleotides were designed, each specific for amplifying NDV fusion protein gene-specific RNA from virulent, avirulent or all isolates respectively. The sensitivity of one-step RT-PCR was determined using viral RNA extracted from serially diluted NDV-infected allantoic fluid and found to be 10(-5) HA units. Application of one-step RT-PCR to various NDV samples, including wild-type virulent isolates and avirulent vaccine strains, demonstrated the potential for rapid identification (3-4 h) of NDV isolates as well as the differentiation of virulent from avirulent strains.     

CpG寡核苷酸增强鸡新城疫疫苗免疫效力的研究

为了探讨CpG寡核苷酸（CpG oligonucleotide,CpG ODN）对鸡新城疫疫苗免疫效力的影响,将CpG2007与鸡淋巴细胞共孵育,测定淋巴细胞增殖率,结果发现CpG2007对鸡淋巴细胞具有显著的刺激活性。将CpG2007与不同浓度的新城疫抗原混合,制备灭活疫苗,免疫健康雏鸡。分别于免疫后不同时间采血,测定抗体效价和细胞因子表达量,并进行攻毒保护试验。结果发现,添加CpG ODN佐剂的试验组均比对应相同抗原剂量的免疫对照组的抗体水平高,产生抗体速度快;抗原剂量降低10倍的佐剂试验组与高抗原剂量免疫对照组抗体水平和攻毒保护率均相当,表明CpG ODN能显著增强新城疫疫苗的免疫效力,能促进机体产生更强烈的免疫应答,是有效的疫苗佐剂候选物质。     

DP1/02株鸭源Ⅰ型副黏病毒F基因真核质粒构建及免疫试验

应用RT-PCR方法从鸭源Ⅰ型副黏病毒DP1/02株中扩增F基因并克隆入pMD18-T载体,经序列测定、分析,DP1/02株F基因与鸡新城疫病毒（NDV）国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到99%。随后将F基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-F,将阳性质粒体外转染Vero细胞,通过间接免疫荧光对真核质粒的表达进行鉴定,利用pCI-F质粒进行动物试验。结果表明构建的真核表达质粒pCI-F能够在Vero细胞中表达,雏鸭免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,二次免疫雏鸭后,对NDV强毒的攻毒保护率为73%。本试验为利用F基因构建的核酸疫苗提供了重要的技术支持。