基因Ⅶ.2亚型新城疫病毒反转录数字PCR检测方法的建立与应用

基因Ⅶ型新城疫病毒（NDV）是严重危害我国家禽养殖业健康发展的主要病原之一。国家新城疫参考实验室监测表明,目前国内NDV流行毒株已由基因Ⅶ.1.1亚型转变为Ⅶ.2亚型。为实现基因Ⅶ.2亚型NDV的快速检测和精准定量,针对其国内流行毒株F基因保守区域设计了特异性引物和探针,建立了一种可快速检测基因Ⅶ.2亚型NDV的反转录数字PCR(RT-dPCR)方法,并评估了该方法的敏感性、特异性和重复性。结果显示：建立的RT-dPCR方法检测下限为1.30 copies/μL,敏感性较高;特异性强,与基因Ⅵ型、Ⅻ型NDV以及其他常见禽病病毒（禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒）无交叉反应;重复性试验变异系数为2.6%,小于3%,重复性好。利用本方法对从活禽市场采集的200份鸡口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,发现检测结果与病毒分离鉴定结果一致。结果表明,本研究建立的RT-dPCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和准确性,可用于基因Ⅶ.2亚型NDV的快速检测和精准定量,同时也为其核酸标准物质的研制奠定了基础。     

基因VI型新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

鸽新城疫是严重危害鸽业健康发展的主要疫病之一,近年来流行呈上升趋势。为满足开展基因VI型鸽源新城疫病毒快速检测的迫切需求,针对国内流行的基因VI型新城疫病毒F基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了一种可特异检测基因VI型新城疫病毒的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性进行了评估。结果显示,该方法与其他基因型新城疫病毒和常见禽病病毒无交叉反应,检测下限为5 copies/μL。利用该方法对临床采集的120份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,检测结果与病毒分离结果完全一致。结果表明,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法特异性强、敏感性高、准确性好,可用于基因VI型新城疫病毒的快速检测。     

实时荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒RNA

根据新城疫病毒（NDV）核苷酸序列，设计针对中、强毒力NDVF基因编码融合蛋白裂解位点的核苷酸序列引物和TaqMan探针，建立了实时荧光定量反转录荧光定量PCR（RRT—PCR）检测中、强毒力NDVRNA的方法。该方法能从舍有NDVI系疫苗毒、NDV标准强毒株F48E9（基因Ⅸ型）、分离鸡源强毒株（基因Ⅶ型）和鸽源强毒株（基因VI型）样本中检出NDVRNA，不与NDV弱毒株（LaSota、Clone30、B1、V4）、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒及健康鸡组织RNA发生交叉反应，对NDV核酸的最小检出量为60个拷贝，具有检测速度快、特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等特点。从9个临床样本中均检测出阳性信号（9／9），PCR产物经测序证明均舍有NDV强毒株F基因裂解位点；用其中8份病料接种SPF鸡胚分离病毒，分离率为5／8。     

鸽A群轮状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

鸽A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)是影响养鸽业健康发展的主要病原之一。为实现鸽RVA的高通量快速检测，根据目前国内外流行的鸽RVA VP6基因保守区域设计特异性引物与探针，建立了一种可以特异性检测鸽RVA的实时荧光RT-PCR方法，并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示，该方法灵敏度高，最低检测限为7.22×10² copies/μL；特异性强，与鸽群其他常见病毒无交叉反应；重复性好，组内与组间重复变异系数均小于1.5%。利用该方法和普通RT-PCR方法对200份临床样品进行检测，发现荧光RT-PCR方法的病毒阳性检出率高于普通RT-PCR方法，二者符合率为94.00%。结果表明，本研究建立的实时荧光RT-PCR方法敏感、特异、准确，重复性好，可为开展鸽RVA的临床检测及流行病学调查提供技术支持。     

基于鸽新城疫病毒M基因实时定量PCR检测方法的建立

研究通过比对鸽源和鸡源新城疫病毒M基因的序列,找到其差异位点并在保守区设计引物和TaqMan探针,建立了一种可以特异性检测鸽新城疫病毒的实时荧光定量PCR方法。以鸽新城疫病毒M基因阳性质粒为模板制作标准曲线并对检测方法的指标进行系统评价。结果显示,该方法的标准曲线为方程为:y=-3.334logX+37.837,相关系数R2=0.992;重组质粒标准品检测下限为1×101 copies/μL,比普通PCR灵敏100倍;特异性试验显示,该方法与鸡新城疫病毒不同毒株及其他常见禽类病毒无交叉反应;重复性试验的组间及组内的变异系数均小于2%,说明本研究建立的实时定量PCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,可应用于鸽新城疫病毒的早期检测,为鸽新城疫病毒的防控提供了技术支持。     

荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。     

荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒方法的建立及验证

根据新城疫病毒F基因的裂解位点序列,设计合成一对引物和TaqMan探针,以本室构建并保存的鹅源新城疫病毒ZJ1株F基因阳性重组质粒作为中、强毒力新城疫病毒RNA定量检测的标准品,建立检测方法。结果表明本试验建立的标准曲线循环阈值（Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为3拷贝/μL,对禽流感病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为中、强毒力新城疫病毒检测提供了一种快速高效的定量检测方法。对28株标准分离株强弱毒力的检测与经典病毒分离方法符合率达100%,对187份临床样品的检测,二者结果符合率接近90.0%。在新城疫病毒临床样品快速检测、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

鸽新城疫病毒可视化LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种简便、快速,适用于基层检测鸽Ⅰ型副黏病毒的方法,研究针对鸽Ⅰ型副黏病毒全基因组保守序列,设计了1组可检测基因Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅩ、ⅩⅪ型分离株的环介导等温扩增(LAMP)引物,通过优化反应条件及体系,建立鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法。结果显示：建立的鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法可检测基因Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅩ、ⅩⅪ型鸽新城疫病毒,与H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、禽网状内皮组织增殖病病毒、小鹅瘟病毒以及禽白血病病毒以及新城疫病毒La Sota疫苗株均无交叉反应,最低检测限为10¹ copies/μL。研究表明所建立的鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法快速、简便,特异性强,灵敏度高,可应用于基层快速检测鸽Ⅰ型副黏病毒。     

基因Ⅶ型新城疫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据Ⅶ型新城疫病毒基质蛋白基因保守序列设计并合成特异性引物,建立快速检测Ⅶ型新城疫病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆Ⅶ型新城疫病毒M基因靶序列,并将其连入T-Easy载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999。检测结果显示,该方法的灵敏度可达100 copies/μL,而且特异性良好,除Ⅶ型新城疫病毒外,对Ⅱ型/Ⅲ型/IV型/Ⅸ型新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究所建立的检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%。对40份实验感染样品的检测结果表明,其检出率为95%,而常规RT-PCR方法检出率仅为70%,表明该方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高、特异性更强。     

荧光定量RT-PCR检测鸡新城疫病毒方法的建立及应用

针对新城疫基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性的探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测NDV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如鸡传染性支气管炎(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克氏病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.9×101拷贝/!L的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于3%。结果表明,本研究所建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于新城疫的定量检测。