旱稻孢囊线虫的快速分子检测

根据旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)和常见孢囊线虫的ITS序列比对分析,设计1对旱稻孢囊线虫特异性引物He–F/He–R,特异性片段长度为281 bp。运用该特异性引物及建立的DNA提取方法和PCR体系,可特异性检测旱稻孢囊线虫单条2龄幼虫,可以从混合有1条旱稻孢囊线虫的0.1 g水稻根组织中特异性检测出目的DNA片段。特异性引物He–F/He–R与通用引物D2A/D3B结合,运用一步双重PCR检测方法可快速鉴定单孢囊,也可从初始分离的田间土壤总线虫样品中直接检测出旱稻孢囊线虫。     

羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用

根据羊口疮病毒(ORFV)H2L基因序列,设计合成1对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊口疮病毒DNA的PCR检测方法.结果显示,用这1对引物均能扩增出羊口疮病毒507 bp的特异性片段,同时检测口蹄疫病毒和山羊痘病毒,结果均为阴性,最小检出量为5 pg.该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床组织病料中的ORFV进行快速检测.     

肉制品中羊源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据羊特异性线粒体DNA片段,设计合成一对引物,并以生、熟羊肉为材料,建立了肉制品中羊源性成分的PCR检测方法,并用于生、熟羊肉的鉴定。PCR扩增产物DNA片段大小为295 bp。用Sau3AⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,酶切产物为204 bp和91 bp。PCR产物和酶切产物的片段大小与预期目标相符,其检测灵敏度达到0.225 pg DNA。合成的羊源性DNA引物可以扩增出羊肉的目的 DNA片段,而对马、狗、驴、兔和猪等14种动物DNA无扩增效果。利用该法对83份羊肉制品进行鉴定,检出率为100%。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

TAIL-PCR对红莲型水稻不育系特异片段HL-spl侧翼序列的分析

以红莲型水稻不育系粤泰A(Y1A)线粒体DNA为模板,在具有细胞质遗传的线粒体特异性片段HL-spl侧翼各设计3条特异性巢式引物(LSP1、LSP2、LSP3、RSPI、RSP2、和RSP3),利用特异性引物和随机引物Adl、AD2和AD3,通过热交错PCR(TAIL-PCR)扩增HL-spl的侧翼序列.通过扩增和序列分析得到了HL-spl 5'侧翼1456 bp和3'侧翼2570 bp的序列.改进后的TAIL-PCR方法为线粒体目的片段的侧翼序列分析提供了一种简单而高效的方法.     

食品中金黄色葡萄球菌PCR检测方法的建立

目的:建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌的PCR方法。方法:优化金黄色葡萄球菌DNA提取方法并设计基因特异性引物,采用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)编码基因,验证检测的特异性及灵敏度。结论:所检出的金黄色葡萄球菌在497bp处出现特异片段,该方法具有较高的敏感性和特异性,可作为食品中金黄色葡萄球菌快速检测的手段。     

苹果黑星病菌的分子检测

【目的】建立苹果黑星病菌(Venturia inaequalis(Cooke)Wint)的分子检测方法,以提高检测精确度,缩短检测时间。【方法】根据苹果黑星病菌与其他苹果病原真菌核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列间的差异,设计了1对特异性引物320A/320B,用于苹果黑星病菌的分子检测,对特异性引物扩增条件进行了优化,并验证和检验了引物的特异性和灵敏度。【结果】特异性引物的扩增条带约为320bp,优化的反应体系为:2μL MgCl2(25mmol/L),2.5μL 10×buffer,3μL dNTP(2.5mmol/L),1.2 μL引物320A/320B(10μmol/L),0.5μL聚合酶(5U/μL),1μL模版DNA(30ng/μL),加ddH2O至总体积25μL;反应程序为:94℃3min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min。利用该对特异性引物对包括苹果黑星病菌在内的26个苹果病原菌菌株基因组DNA进行的PCR扩增表明,只有苹果黑星病菌能扩增到1条约320bp的特异性条带,其他菌株及阴性对照的扩增产物均未检测到特异性条带。对接种苹果黑星病菌的苹果组织的检测表明,该对引物能特异性地检测到苹果黑星病菌的存在,其对苹果黑星病菌基因组DNA检测的灵敏度为100fp/μL。【结论】利用设计的特异性引物320A/320B,参考正交试验优化的体系和程序,结合简单的SDS法提取苹果黑星病菌基因组DNA,在1个工作日内即可完成对该病原菌的分子检测。     

TAIL-PCR对红莲型水稻不育系特异片段HL-sp1侧翼序列的分析

以红莲型水稻不育系粤泰A（YTA）线粒体DNA为模板,在具有细胞质遗传的线粒体特异性片段HL-sp1侧翼各设计3条特异性巢式引物（LSP1﹑LSP2﹑LSP3﹑RSP1﹑RSP2、和RSP3）,利用特异性引物和随机引物AD1﹑AD2和AD3,通过热交错PCR（TAIL-PCR）扩增HL-sp1的侧翼序列。通过扩增和序列分析得到了HL-sp1 5′侧翼1 456 bp和3′侧翼2 570 bp的序列。改进后的TAIL-PCR方法为线粒体目的片段的侧翼序列分析提供了一种简单而高效的方法。     

复合PCR鉴定巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的方法

在已经建立的多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了PM、HIS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增多杀性巴氏杆菌的457 bp和副猪嗜血杆菌的1 090 bp的特异性片段.检测灵敏度分别达7.2 Pg DNA/1 040 CFU和16.0 Pg DNA/2 300CFU,用所建方法检测临床分离的23株可疑菌株和本实验室人工感染猪分离菌,结果显示,23株可疑株有2株检出多杀性巴氏杆菌特异性条带,没有检出副猪嗜血杆菌特异性条带;人工感染分离菌株均扩增出副猪嗜血杆菌特异性条带.表明该方法能够对临床上这2种疾病进行鉴别诊断.     

多重PCR同时检测鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG方法的建立和临床应用

通过建立针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断技术,并进行了特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明：设计的5对引物对同一样品中的RNA（AIV、NDV、IBV）和DNA（ILTV、MG）进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp（AIV）、321bp（NDV）、457bp（IBV）、662bp（ILTV）和732bp（MG）。说明该多重PCR技术具有较强特异性和较高敏感性,能检测出1pgAIV、1pgNDV、10pg IBV的RNA和1pg ILTV、10pgMG的DNA。对自然感染鸡临床样品检测的结果则证明,该技术在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测试剂盒的研究

根据已发表的结核分枝杆菌23S rRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了2对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,并研制出检测试剂盒。结果表明,该检测试剂盒对结核分枝杆菌能特异性地扩增出838 bp条带而扩增不出631 bp条带,牛分枝杆菌能特异地扩增出838 bp和631 bp条带,而对其他牛菌株的DNA扩增结果均为阴性;敏感性试验表明最低能检测出50 pg的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌DNA模板;保存期测定结果表明,在-20℃条件下保存至1、3、6、9个月时,试剂盒的敏感性无明显变化,仍能检测到50 pg的DNA模板,保存至12个月时其敏感度仍能100%检出阳性样品。     

百合炭疽病病原菌PCR检测技术

百合炭疽病是百合（Liliumlongifzorum）种球上重要病害之一,其病原为百合炭疽病菌（ColletotrichumliliiPlakidas）。通过百合炭疽病菌与常见胶孢炭疽病菌（C．gloeosporioides ）等4种不同炭疽病菌种类的核糖体DNAITS序列比对设计特异性引物,通过特异性检验,确定BT73／BT-RSl0和BT-F98／BT-R510。2对引物均可以分别扩增出438bp和413bp的百合炭疽病菌目标片段,而对常见4种炭疽病菌及百合球茎上2种常见的病原菌百合枯萎病菌及灰霉病菌均不能扩增出相同的目标片段。用引物对F73／BT-R510和BT-F98／BT-R510特异性PCR扩增百合炭疽病菌的灵敏度分别都在50pg以上。用外圈引物对F73／BT-R510和内圈引物对BT-F98／BT-R510进行巢式PCR扩增,对百合炭疽病检测的灵敏度提高不明显。     

番茄白粉菌的PCR分子检测

根据番茄白粉菌核糖体DNA的ITS(internal transcribed spacer)序列的特异性,设计2对引物OidF1/R1、OidF2/R2,对番茄白粉菌进行了PCR特异性扩增试验。结果表明:2对引物都可以从番茄白粉菌基因组DNA中扩增出350 bp左右的特异性扩增产物,并具有专一性,只在白粉菌和接种感病组织DNA中有扩增条带,而番茄早疫病菌、叶霉菌以及健康组织DNA中均无特异性扩增片段;引物具有高度的灵敏度,可以检测含有1 ng的番茄白粉菌DNA。由此证明,该方法可快速、准确和灵敏地鉴定和检测番茄白粉病的发生。     

用SSR标记和巢式PCR快速检测大豆疫霉菌

 【目的】建立快速、准确的大豆疫霉菌检测和病害早期诊断分子技术。【方法】基于大豆疫霉菌SSR标记Psc239设计两对引物Psc239EF/Psc239ER和Psc239F/Psc239R,建立特异性检测大豆疫霉菌的巢式PCR方法。【结果】用36个大豆疫霉菌分离物和25个其他卵菌和真菌分离物基因组DNA评价引物及巢式PCR的专化性,引物对Psc239EF/Psc239ER、Psc239F/Psc239R和巢式PCR反应只在大豆疫霉菌中分别扩增出519、242和242 bp的特异片段,在其它卵菌和病原真菌中不扩增片段;用两对引物进行常规PCR扩增,检测大豆疫霉菌DNA的灵敏度均为50 pg?μl-1,而巢式PCR的灵敏度为50 fg?μl-1;巢式PCR检测土壤中卵孢子的灵敏度为每克土壤0.4个卵孢子;巢式PCR能够特异地从大豆病株和土壤中检测到大豆疫霉菌。【结论】基于SSR标记建立的巢式PCR方法能够用于大豆疫霉菌的快速检测和病害诊断。     

PCR法快速检测扩张青霉

 【目的】研究棒曲霉素扩张青霉菌（Penicillium expansum）的快速和特异性PCR检测方法。【方法】通过P.expansum的纯菌平板和液体培养以及纯菌接种于苹果、苹果果肉和苹果汁,用Cenis改良方法提取DNA,以基于isoepoxydon dehydrogenase和polygatacturonase编码基因的两对引物扩增P.expansum DNA,建立特异和快速的检测P.expansum的方法。【结果】基于polygatacturonase基因的引物具有很强的特异性,只有目标DNA片段被扩增,而基于isoepoxydon dehydrogenase基因的引物扩增特异性较差。纯培养可以检测到5×10-6 μｇDNA/每反应体系,整个检测时间约为5 h,比传统培养法（4～6 d）时间大大缩短。苹果、苹果果肉和果汁接种纯P.expansum后所提DNA都得到了很好的扩增,具有很高的特异性,不受苹果样品DNA的干扰。【结论】本研究建立的P.expansum的PCR检测方法特异、快速、灵敏,可用于商品果汁和苹果汁工业化生产中P.expansum的快速检测和质量控制,也可用于工艺过程对P.expansum污染的快速溯源。     

2种PCR方法扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列比较

比较了扩增已知序列5’侧翼序列的2种PCR方法.方法一是反向PCR (IPCR),以大豆基因组酶切后的DNA片段自身环化产物做模板,用2对特异引物反向扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列.方法二是热不对称交错PCR(rAIL- PCR),以大豆基因组DNA为模板,用3个巢武特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环...     

野猪肌细胞生成素基因的克隆与序列分析

参考家猪(X89007)MyoG基因序列设计2对特异引物,用PCR方法首次从野猪基因组中扩增出2个大小分别约为1.6 kb和1.0 kb的DNA片段,其PCR产物经pMD-18T载体转化感受态DH5α株大肠杆菌,获得重组克隆子。DNA测序和序列拼接表明:野猪肌细胞生成素基因DNA序列长2 466bp,含完整的3个外显子和2个内含子,与家猪、牛、马、狗、小鼠和人的MyoG基因的cDNA序列同源性分别为99.8%、92.4%、92.7%、89.7%、90.8%和94%,其cDNA编码氨基酸序列与家猪、牛、马、狗、小鼠和人的同源性分别为100%、96.4%、95.9%、94.1%、96.4%、96.8%;对野猪MyoG基因组序列与9个家猪品种的相应同源序列进行比较,检出16个核苷酸变异位点,且其中有5个为家猪中不具有的新变异位点,其变异位点主要发生在内含子部分,尤其是内含子1中的变异位点比例最大(11个)。这些结果表明,野猪肌细胞生成素基因的编码序列在进化过程中是高度保守的,而内含子部分尤其是第1内含子具有丰富的序列多态性。对117个限制性酶切位点扫描分析发现,野猪MyoG基因核苷酸序列中含有78个酶切位点,其中有5个酶切位点包含变异位点,尤其是1 153位点的T突变成G所产生的SmaI(CCC/GGG)或XmaI(C/CCGGG)酶切位点为野猪所特有。所测DNA序列已提交到GenBank中,获得的序列号为:FJ356697。     

牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法研究

根据牛SRY基因序列设计合成了2对嵌套式引物作为公牛特异性引物,同时根据牛β珠蛋白基因(HBB)序列设计了1对引物作为内参照引物,建立了巢式PCR反应体系。对50头母牛和30头公牛DNA样品的检测表明,母牛只能扩增出558 bp的HBB基因片段,而公牛则可以扩增出558 bp的HBB基因片段和219 bp的SRY基因片段,其鉴定结果与实际性别一致。同时,以微量的卵母细胞和精子细胞为模板对该反应体系的灵敏性进行了检验,结果表明,该反应体系可对10个细胞水平进行准确鉴定。     

松杨栅锈菌两菌群RAPD特异序列的标记转换

 【目的】根据RAPD分析结果,对松杨栅锈菌西部和北方两大地理相关菌群RAPD扩增特异性DNA片段进行SCAR标记转换。【方法】经pGEM-T载体克隆和测序、Seqman整合后,用Primerselct分别设计了两地理菌群的简并引物对（西部菌群简并引物对PNW0118-382-F:GAATCGGCCACAAAACTATC,PNW0118-382-R:GAATCGGCCATGACTTGAGC,北方菌群简并引物对PNW0118-400-F:GAATCGGCCACAAAACTATC,PNW0118-400-R:GAATCGGCCATGACTTGAGCTGC）。【结果】经PCR条件优化成功获得两大地理菌群的SCAR标记。西部菌群SCAR标记为382 bp,北方菌群的SCAR标记为400 bp。【结论】两对引物可用于松杨栅锈菌地理菌群的检测。     

CAV和ALV混合感染病例的诊断

本实验从10羽130日龄发病海兰白蛋鸡中分离组织病料,并进行药敏试验及PCR诊断。根据CAV、ALV已有引物,通过PCR方法检测,结果显示:样本均能扩增出584bp和1260bp的片段,即CAV和ALV均为阳性,确诊为CAV与ALV混合感染。测序结果显示,同源率分别可达97.3%～99.1%和98.3%～99.4%。     

RT-PCR和Digoxigenin标记的核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒试验研究

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一ＩＢＶＨ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ，分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０ｂｐ，２２８ｂｐ，６０２ｂｐ，的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０，Ｈ５２，Ｍ４１，Ｃｏｎｎ，Ｇｒａｙ，Ｔ，Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒，上毒，云毒，ＨＫ，１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ。结果除Ｈｏｌｔｅ株，２个分离株（宜毒，云毒）外，其余均被成功地扩增出６０２ｂｐ的片段。将ＩＢＶＨ１２０株０６ｋｂＰＣＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记为探针，分别与上述各ＩＢＶ毒株的核酸及其扩增产物进行核酸杂交，均呈现阳性反应，而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＤＮＡ，ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液抽提物反应。ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交技术提供了直接从尿囊液中快速检测出病毒，作为诊断ＩＢＶ的新方法。