苹果纯合基因型新种质的性状鉴定与培养

【目的】苹果花药培养获得的纯合基因型株系来自不同的花粉粒,因此不同株系的植物学特征、生物学特性,以及诱导培养、生根的条件等都存在差异。本研究对不同个株系试管苗的倍性、表型特征、生根培养条件进行观察分析,选出苹果纯合基因型株系适宜的生根条件及综合性状较好的株系,加强苹果种质资源创新。【方法】采用花药培养获得的‘嘎啦’‘富士’‘红星’纯合基因型株系,利用流式细胞仪分析每个株系倍性,探索组培苗的生根培养条件,观察每个株系的根系、叶片形态特征。【结果】经苹果花药培养获得32个纯合基因型株系,其中单倍体1株、三倍体1株、四倍体3株、二倍体27株,‘红星’苹果纯合基因型株系的倍性分化率最大,为28.57%。IBA浓度影响再生株系的生根率、根长及根数,苹果纯合基因型株系的最适宜生根浓度为IBA 2—3 mg·L-1。各个株系的叶数、根长、根数、株高、叶形指数(叶长度/叶宽度)、叶柄有一定差异。‘红星’纯合基因型DH0-1、DH0-3、DH0-4、DH0-7株系,‘富士’纯合基因型DH1-3株系,‘嘎啦’纯合基因型DH2-2、DH2-4、DH2-12、DH2-20株系综合性状较好(植株高、根系长、叶数和根数多)。‘红星’纯合基因型株系的移栽成活率最高,为28.57%。【结论】苹果纯合基因型株系的主要倍性为二倍体。与二倍体株系相比,单倍体株系叶基窄、叶柄细、叶色和叶缘锯齿较浅,而多倍体株系表现为叶基更阔、叶柄较粗、叶色和叶缘锯齿变深。     

花药培养研究及其在生产上的应用

一、花药培养概况花药培养是将花药离体后进行培养,使花粉发育成单倍体植株。单倍体植株染色体加倍后,成为具有同型遗传因子的纯合二倍体,不仅能正常开花结实,而且植株后代整齐一致,性状稳定,这在育种工作中和生物理论研究上都具有重要意义。因此很早就有人提出单倍体育种的设想,企图通过某种方法从杂交后代产生大量单倍体,加倍后变成纯合二倍体直接用于选种实践,但未找到大     

大白菜游离小孢子的培养及植株再生

为快速创新蔬菜种质材料,缩短大白菜杂交育种工作中自交系的选育过程,对10个优良大白菜杂交种进行游离小孢子培养。结果表明,采用游离小孢子培养方法1～2年内可获得双单倍体(DH)纯合植株,在供试的10个基因型中,有6个得到胚状体,胚诱导成功率为60%,不同基因型之间最高和最低的小孢子产胚数相差极大,春秋霸王平均每花蕾产胚10.92个,天绿58平均每花蕾产胚0.17个;出胚基因型中有5个基因型得到植株,植株诱导率为83%;经田间观察得到20个以上的株系,2012年春季试配杂交组合。     

丹霞苹果纯合基因型株系形态学分析

丹霞苹果花药培养获得来自不同花粉粒的纯合基因型株系,这些纯合基因型株系的叶片形态特征、根系形态特征等具有差异性,选育出具有优良性状的株系对苹果种质创新具有重要意义。苹果花药培养试管苗与供体试管苗相比更加脆弱,在移栽过程中不容易存活。因此,探究丹霞苹果纯合基因型株系的移栽条件是进行新种质选育的关键性一步。以8个丹霞苹果纯合基因型株系为材料,通过观察分析根系生长特性、叶片形态特征,选出具有优良性状的株系,同时筛选再生株系的移栽条件。结果表明,丹霞苹果纯合基因型株系的根长、根数、叶长度、叶宽度、叶柄长度、叶缘、叶色等表现出明显差异,DH3-3,DH3-4,DH3-8株系的根系生长状态,叶宽度、叶长度、叶柄长度显著优于其他株系;丹霞苹果纯合基因型株系直接移栽的植株生长状态良好。     

花药培养研究及其在生产上的应用

花药培养是将花药离体后进行培养,使花粉发育成单倍体植株。单倍体植株染色体加倍后,成为具有同型遗传因子的纯合二倍体,不仅能正常开花结实,而且植株后代整齐一致,性状稳定,这在育种工作中和生物理论研究上都具有重要意义。因此很早就有     

石刁柏花粉胚的发生及纯合株的快速鉴定

本试验以32℃热激结合暗培养显著地提高了石刁柏花药培养中胚状体的诱导频率。不同基因型对胚状体发生频率影响很大。石刁柏胚状体的分化,固体培养比浅层液体培养效果好。通过胚状体途径可以克服石刁柏组织培养中生根难的问题,但再生植株的染色体数仍然有较大的变异,单倍体、二倍体、四倍体、非整倍体和混倍体分别占5%,50%,20%,15%,10%。利用石刁柏茎莽草酸脱氢酶的多态性位点 SKD-1和根醣酶多态性位点 EST-1结合细胞学方法对再生植株进行检测的初步结果是:单倍体占5%、纯合二倍体占8.33%、杂合二倍体占41.67%、纯合四倍体占6.67%、杂合四倍体占13.33%、花粉起源的非整倍体占3%、体细胞起源的非整倍体占12%。     

大麦空间诱变与小孢子培养复合育种技术及应用

供试大麦品系的种子搭载卫星上天,返回地面后种植于大田,取其植株花药中的小孢子(单倍体细胞),进行高盐、低氮、缺水、病菌毒素等胁迫因子的离体培养,筛选出携带抗性变异基因的胚状体,再经胁迫分化培养,获得具相应抗性的再生苗,通过染色体自然或人工加倍,获得加倍单倍体纯合抗性再生植株,自交一代经大田的高盐、低氮、缺水、病菌接种鉴定,筛选出抗盐、耐低氮、抗旱、抗病能力明显提高的优异新种质,通过进一步的综合农艺性状考察,即可以在2年内获得耐盐、节肥、抗旱、抗病新品系.     

利用离体小孢子培养技术培育叶用芥菜耐抽薹新品系研究

为了快速选育叶用芥菜耐抽薹新品种，以贵州本地资源威宁青菜和修文青菜2个基因型为供体材料进行离体小孢子培养。结果表明，2个基因型均诱导出胚，产胚量分别为29.5胚/蕾和15.6胚/蕾；选取子叶形胚接种到再生培养基，进行诱导培养形成再生植株，成苗率达88.33%。2个基因型诱导出的单倍体在秋水仙素质量浓度为100.0 mg/L时加倍效率最佳，分别为52.00%、67.40%；对260株再生株进行倍性鉴定，检测到单倍体、双单倍体、非整倍体、单倍体+二倍体嵌合体、二倍体+四倍体嵌合体5种类型，其中，威宁青菜单倍体占87.50%，双单倍体占8.75%，其他倍性占3.75%；修文青菜单倍体占77.50%、双单倍体占17.50%，其他倍性占5.00%。不同倍性材料田间表现，单倍体无花粉，不结实，植株矮小；单倍体+二倍体嵌合体正常开花结实，植株长势强，但有部分空荚；非整倍体虽有花粉，但是结荚小，种子较小、不饱满，植株长势较弱；双单倍体、二倍体+四倍体嵌合体长势较好，有花粉，并且种子饱满，量多。因此，可先根据植株田间表现判断倍性，再选择性进行倍性检测。利用小孢子培养技术获得了威宁青菜和修文青菜优良叶用芥...     

硬粒小麦单倍体高效再生体系的建立

硬粒小麦×玉米形成的单倍体幼胚,由于缺乏胚乳滋养往往发育不良,致使幼胚培养成苗率很低。本试验通过诱导杂种幼胚产生愈伤组织的途径,建立起高效硬粒小麦单倍体植株再生系统,从而可以大量获得单倍体试管苗,为经植株移栽和染色体人工加倍后仍能获得大量成活的纯合二倍体植株提供了保证。     

单胚性二倍体为母本与异源四倍体杂交大规模创制柑橘三倍体

【目的】以单胚性的二倍体柑橘品种为母本与异源四倍体体细胞杂种杂交培育三倍体植株。【方法】选择亲本配置杂交组合进行人工授粉,授粉后70—100 d采幼果进行胚挽救,以流式细胞仪结合根尖染色体压片对再生植株进行倍性检测,最后进行SSR分子标记鉴定。【结果】2009—2012连续4年,以8个二倍体为母本、以4个异源四倍体体细胞杂种为父本,共配置14个倍性杂交组合,授粉花数3 347朵,坐果数678个,平均坐果率20.26%。实施胚挽救的果实数505个,培养种子12 357粒,经生芽、生根诱导培养共获得1 022个株系。通过对再生植株的倍性检测,共获得三倍体植株755个株系,四倍体19个株系。对华农红柚 × NH组合的三倍体、四倍体后代进行分子鉴定,表明三倍体和四倍体全部为双亲的有性杂种后代。【结论】本研究通过杂交获得的三倍体为我国无籽柑橘品种选育奠定了材料基础;同时获得的四倍体后代也为未来的柑橘三倍体育种提供了优良的亲本材料。     

金冠×四倍体嘎拉杂种F1代的倍性分析

[目的]对金冠×四倍体嘎拉杂种F1代的倍性组成进行分析,以便鉴定出三倍体新种质;同时,为今后多倍体育种的亲本选择提供借鉴.[方法]以田间F1代植株茎尖幼嫩叶片为试材,利用流式细胞仪对杂种F1代个体进行了分析.[结果]32株的倍性得到了确认:包括三倍体27株,二倍体4株,单倍体1株,未发现有四倍体植株.三倍体比率高达84.4;,二倍体和单倍体的比率分别为12.5;和3.1;.[结论]金冠×四倍体嘎拉杂交组合是一个优良的创制三倍体新品种/种质的组合,今后可以利用其进行更大规模的杂交育种.     

玉米单倍体胚芽鞘节组织培养特性研究

【目的】研究玉米单倍体胚芽鞘节组织培养特性,为单倍体加倍提供一条新的途径。【方法】以Reid群、黄早四群和温热Ⅰ群群内杂交20个组合的单倍体胚芽鞘节为外植体,分析愈伤组织的诱导率和分化率,并对再生植株根尖染色体数目进行观察和花粉育性分析;同时使用SSR分子标记,分析再生植株的基因型。【结果】Reid群和黄早四群的单倍体芽鞘胚节愈伤组织的诱导率比温热Ⅰ群高,达极显著水平;共获得15株单倍体植株,根尖染色体数目为10;I-KI染色发现,散粉的花药,其花粉为部分可育;15株单倍体植株的遗传稳定,未见变异。【结论】Reid群和黄早四群的单倍体胚芽鞘节组培特性较好,温热Ⅰ群较差;组织培养产生的单倍体植株遗传型均来自双亲的重组类型。建立了玉米单倍体胚芽鞘节组织培养体系。     

青梗菜优异DH系的创制与利用

 【目的】创制多样性的青梗菜DH系,应用于杂种优势育种实践。【方法】以15个优良青梗菜杂交种为试材进行游离小孢子培养,通过优化培养条件建立高效培养体系。【结果】获得了373株小孢子植株;鉴定出251株双单倍体;筛选出7个优异DH系;配制出2个优良组合。【结论】建立了利用游离小孢子培养技术创制青梗菜DH系及其杂种优势育种的技术体系。     

不同授粉组合对‘富士’和‘新红星’苹果品质的影响

【目的】探讨不同授粉品种对苹果品质和香气物质成分差异的影响,为高效授粉树的选育和苹果品质的提高提供依据。【方法】采用自育高效授粉树‘红菱’‘红锦’‘红雾’的花粉,在‘富士’(Malus domestica‘Fuji’)、‘新红星’(M.domestica‘Starkrimson’)铃铛花期进行授粉,以授‘嘎拉’(M.domestica‘Gala’)花粉的果实为对照,对果实发育期间总类黄酮含量的变化进行研究,并在果实成熟时测定可溶性固形物、花色苷含量等品质指标及香气物质成分。【结果】不同的授粉品种条件下,‘富士’和‘新红星’苹果除可滴定酸外的各项品质指标均高于对照。‘富士’苹果经‘红菱’授粉后,其果形指数、硬度、花色苷、可溶性糖含量显著提高,分别为对照的1.12、1.15、1.28、1.12倍。‘新红星’苹果经‘红雾’授粉后,其单果重、果形指数、花色苷、可溶性固形物、可溶性糖含量均显著提高,分别为对照的1.22、1.12、2.48、1.10、1.11倍,其可滴定酸含量显著降低,仅为对照的75%。在果实发育的整个生长期内,不同授粉品种处理的‘富士’和‘新红星’苹果总类黄酮含量均高于对照,且不同品种间存在显著差异。在花后160 d,‘富士’经‘红菱’‘红锦’‘红雾’花粉授粉后,果实内总类黄酮含量与对照相比分别增长19.63%、28.72%、13.97%,‘新红星’在花后120 d分别增长14.18%、15.26%、4.24%,差异显著。‘红菱’‘红雾’‘红锦’和对照授粉处理的‘富士’和‘新红星’苹果总酯类挥发性物质的相对含量分别为50.20%、52.03%、42.68%、45.10%和71.08%、68.85%、71.83%、66.03%,‘红菱’授粉后‘富士’‘新红星’果实总酯类挥发性物质含量明显增加,其中2-甲基丁酸乙酯的含量分别为对照的1.14和203.91倍。‘富士’苹果中,‘红菱’‘红雾’‘红锦’授粉处理的果实乙酸-2-甲基丁酯的含量分别为对照的1.73、1.07、1.36倍;其己酸乙酯和乙酸丁酯的含量分别为对照的1.09、1.12、1.29倍和1.50、0.77、1.30倍。而在‘新红星’苹果中,经‘红菱’‘红雾’‘红锦’授粉后,乙酸-2-甲基丁酯和己酸乙酯的含量分别为对照的1.82、1.27、0.93倍和2.57、1.15、0.27倍;乙酸丁酯的含量分别为对照的7.83、3.48、3.30倍。此外,‘富士’和‘新红星’苹果经‘红菱’授粉后,其烃类物质含量明显高于对照,主要表现为法呢烯的增多。【结论】高效授粉树能显著提高‘富士’和‘新红星’苹果的外观和内在品质,并且与对照存在显著差异。不同授粉组合对‘富士’和‘新红星’苹果品质影响差异较大,经‘红菱’授粉,‘富士’和‘新红星’苹果品质有显著提高。     

苹果异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1的克隆及功能鉴定

【目的】异三聚体G蛋白(Heterotrimeric G protein)作为植物生物体内重要的信号转导分子,在感受外界环境刺激、参与植物抗逆反应和跨膜信号转导等方面发挥着重要作用。克隆异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1,并在烟草中过量表达MdGPA1,对其进行生物学功能鉴定和生理指标分析,为多年生木本植物响应环境因子信号转导过程中的分子机理研究提供参考。【方法】本研究以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为研究试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆获得MdGPA1。使用MEGA5.0构建GPA1物种间系统进化树;利用qRT-PCR方法检测该基因在苹果受非生物胁迫诱导表达及组织特异性表达情况。构建MdGPA1植物过表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶片,比较干旱胁迫条件下野生型和转基因株系的表型与生理指标,验证MdGPA1在植物干旱胁迫条件下的生物学功能。【结果】克隆得到苹果异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1(基因序列号:MDP0000881842),该基因长为1 173 bp,编码390个氨基酸。进化树分析表明MdGPA1与白梨Pb GPA1亲缘关系最近,同源性最高。基因表达分析显示MdGPA1主要在叶片中表达,在根系中的表达量次之,在茎和果实中的表达量较低。定量分析表明,该基因参与干旱、低温和盐等非生物逆境胁迫响应,在150 mmol·L~(-1)Na Cl、150 mmol·L~(-1)甘露醇、10%PEG和4℃胁迫条件下表达量明显下调,在5%H_2O_2胁迫处理下表达量明显上调。在烟草中过量表达MdGPA1,发现MdGPA1转基因烟草表现出对干旱敏感的表型特征,其叶片鲜重、叶绿素含量以及脯氨酸含量明显低于野生型烟草。在地下部,MdGPA1转基因烟草同样表现出对干旱敏感的表型特征;其根系形态相比于野生型较小,干重也明显低于野生型。【结论】MdGPA1参与了植物感受外界环境刺激的过程,对干旱、低温和盐等非生物逆境胁迫都存在着不同程度的响应。在烟草中异源表达MdGPA1后,提高了烟草对干旱的敏感性,转基因烟草表现出不耐干旱的表型,受干旱胁迫比野生型烟草更为严重,说明MdGPA1在响应植物抗旱胁迫中起着负调控作用。     

苹果生长素响应因子MdARF5的克隆与功能鉴定

【目的】分离苹果生长素响应因子MdARF5（Auxin Response Factor 5）,分析其对生长素的响应,鉴定其在调节花青苷合成过程中的作用,揭示MdARF5的生物学功能,为进一步研究生长素对花青苷的调节提供理论依据。【方法】以‘嘎拉’苹果（Malus×domestica ‘Royal Gala’）为材料,利用同源克隆技术,克隆得到一个ARF（Auxin Response Factor）转录因子,并将其命名为MdARF5。利用MEGA5.0软件构建多物种间系统进化树。通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织花青苷积累的差异。利用烟草叶片瞬时转化试验,分析MdARF5对MdMYB1的转录调控。【结果】克隆获得苹果生长素响应因子MdARF5（序列号：MDP0000143749）,该基因CDS为2 691 bp,编码含有896个氨基酸的蛋白。系统进化树分析表明,苹果MdARF5与梨PbARF5同源性最高。基因表达分析显示,该基因响应生长素处理,并且与花青苷合成相关基因表现出相反的表达模式。在苹果愈伤组织中超表达MdARF5,其花青苷积累较野生型显著降低,表明MdARF5在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对苹果MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含一个MdARF5的结合位点。烟草瞬时表达试验显示,MdARF5能够抑制MdMYB1的表达。【结论】推测苹果MdARF5可能通过直接抑制MdMYB1的表达负调节花青苷的积累。     

苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10的克隆及功能鉴定

【目的】克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10,研究其组织表达模式和低磷响应,并进一步研究MdPAP10在低磷条件下的功能,为深入研究MdPAP10在果树中参与紫色酸性磷酸酶分泌和影响磷吸收的分子机理奠定基础。【方法】本研究以‘嘎啦’苹果（Malus×domestica‘Royal Gala’）为试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10。通过NCBI分析MdPAP10的蛋白质结构并获得白梨、桃和草莓等10个物种的PAP10氨基酸序列,利用MEGA5.0构建系统进化树。利用qRT-PCR检测MdPAP10在苹果不同组织的表达情况和对低磷胁迫的响应特性。将MdPAP10连接到植物过表达载体pBI121,转化LBA4404农杆菌,用于侵染苹果愈伤组织。通过在抗性培养基上筛选和PCR鉴定,获得MdPAP10转基因愈伤组织。在低磷培养基上培养MdPAP10转基因愈伤组织检测其酸性磷酸酶积累情况以及对低磷胁迫的耐受性和磷含量。最后利用qRT-PCR检测MdPAP10转基因愈伤组织中磷相关基因的表达量。【结果】克隆获得苹果紫色酸性磷酸酶基因MdPAP10（基因序列号：MDP0000272096）,开放阅读框为1 332 bp,编码含有443个氨基酸的蛋白。蛋白质结构分析显示,MdPAP10包含一个信号肽和一个磷酸酶结构域。基因结构分析显示,MdPAP10含有5个外显子和4个内含子。进化树分析显示,苹果MdPAP10与白梨PbPAP10同源性最高,亲缘关系最近。表达分析显示,MdPAP10在根、茎、叶、花、果中均有表达,并且在根中的表达量最高。MdPAP10对低磷条件有明显响应,在根中表达量逐渐升高,在6 h达到最大后逐渐下降;在叶中的表达量始终低于对照组。MdPAP10转基因愈伤组织在低磷条件下能够明显促进酸性磷酸酶的分泌。在低磷条件下培养转基因愈伤组织20 d发现过表达MdPAP10提高了愈伤组织对低磷胁迫的耐受性,并且提高了对磷的吸收。qRT-PCR结果显示,过表达MdPAP10能够明显促进苹果磷相关基因的表达。【结论】MdPAP10能够对低磷胁迫有明显响应,在低磷条件下能够促进磷吸收和酸性磷酸酶的分泌。MdPAP10在响应低磷胁迫过程中发挥着重要的正调控作用。     

苹果液泡膜葡萄糖转运蛋白基因MdVGT1的克隆与表达分析

【目的】研究新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆1号’液泡膜葡萄糖转运蛋白基因MdVGT1生物学信息、表达水平及其在糖代谢中的功能,旨在为进一步完善功能型苹果育种的理论与技术体系提供参考。【方法】以新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆1号’为试材,克隆MdVGT1,对其进行生物信息学分析;并采用荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同发育时期的表达,分析‘嘎啦’组培苗中该基因在葡萄糖诱导下的表达,通过酵母双杂交验证其互作关系,并通过原核诱导获得重组蛋白。【结果】在‘红脆1号’中克隆获得MdVGT1全长,测序发现其包含1 506 bp完整的开放阅读框,编码501个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为53.16 kD,等电点为5.92,定位于苹果基因组的1号染色体上,由14个外显子和13个内含子构成;糖代谢相关基因系统进化树分析表明,MdVGT1与AtVGT1、VvVGT1、CsVGT1在同一个进化枝上,功能域分析表明,MdVGT1蛋白含有12个跨膜区域;MdVGT1在苹果的花、叶和幼果中均有较高的表达,在果实发育中,其表达量与葡萄糖含量有显著的相关性;MdVGT1启动子含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件;葡萄糖处理‘嘎啦’组培苗一周后,MdVGT1的表达量明显提高;酵母双杂交试验表明,MdVGT1与MdTMT1在体外能相互作用,并通过原核诱导获得了MdVGT1的重组蛋白。【结论】在‘红脆1号’苹果中克隆获得了液泡膜葡萄糖转运蛋白基因MdVGT1,其可能与MdTMT1互作共同转运葡萄糖进入液泡膜。     

抱子甘蓝花培苗倍性的快速鉴定

采用花药培养获得加倍单倍体 (DH)是甘蓝类蔬菜自交不亲和系选育的主要方法之一 .然而 ,花药培养后代是倍性水平不同的混合群体 ,及早鉴定出真正的 DH具有重要的意义 .本文阐述 DNA流式细胞仪测定法和形态学鉴定法在花培苗倍性鉴定上的应用 ,并以抱子甘蓝的花培苗群体为材料 ,采用这两种方法鉴定其倍性组成 .结果表明 ,DNA流式细胞仪测定法可以鉴别群体的各种倍性水平 ,而形态学鉴别法可以把群体中的二倍体与单倍体、四倍体及其它倍体分开 .若以 DNA流式细胞仪测定法的鉴定结果为标准 ,苗期形态学鉴定的准确率可达 94.2 % .与 DNA流式细胞仪测定法相比 ,形态学鉴定方法具有更快速、简便和实用性强等特点