小麦锌指转录因子TaDi19A对低温的响应及其互作蛋白的筛选

【目的】锌指类转录因子在植物逆境信号转导和非生物胁迫响应中发挥重要的作用。通过对小麦锌指转录因子基因Ta Di19A的耐冷性能进行鉴定,利用酵母双杂交技术筛选并获得与Ta Di19A互作的候选蛋白,以解析Ta Di19A介导的抗逆调控机制。【方法】通过对低温处理的小麦转录组测序结果进行分析,获得一个锌指类转录因子Ta Di19A。利用生物信息学的方法分析Ta Di19A的分子特性,用SMART在线工具进行蛋白结构分析;用GSDS和PHYRE2在线工具分别对Ta Di19A结构和蛋白三级结构进行分析;用Net Phos 2.0 Server数据库预测Ta Di19A蛋白磷酸化位点。以低温处理的小麦c DNA作为模板,通过SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR,检测Ta Di19A在低温处理不同时间段的表达模式。构建植物表达载体p BI121-Ta Di19A,通过花序侵染法转化拟南芥,用T3代拟南芥进行耐冷性鉴定,分析低温处理对转基因拟南芥的根长、鲜重和存活率的影响。检测转Ta Di19A拟南芥中抗逆相关基因表达变化,分析Ta Di19A调控植物耐冷性的作用机制。构建诱饵载体p GBKT7-Ta Di19A,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,将诱饵载体p GBKT7-Ta Di19A和小麦c DNA文库共转化酵母AH109感受态细胞,通过SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-α-gal显蓝反应筛选得到阳性克隆,测序和BLAST分析获得候选蛋白。【结果】小麦Ta Di19A编码区全长747 bp,编码248个氨基酸,分子量为28.03 k D,等电点为4.74,基因含4个外显子,3个内含子。Ta Di19A蛋白靠近N-端包含锌指结合结构域,C端为Di19结构域,预测的Ta Di19A蛋白三级结构包含2个α螺旋结构。磷酸化位点分析结果显示Ta Di19A蛋白含有12个丝氨酸、9个苏氨酸和3个酪氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR结果显示,Ta Di19A受低温胁迫诱导表达。正常生长条件下,转基因和野生型拟南芥没有明显差异,低温处理下,转基因拟南芥的根长明显大于野生型拟南芥,并且耐冷性强于野生型拟南芥。下游基因检测结果表明,低温处理后,CBL1、CBL2和KIN1等冷胁迫响应相关基因在野生型和转基因植株中表达量都升高,在转基因植株中的表达量显著高于野生型,表明Ta Di19A可能通过调节下游冷胁迫响应相关基因的表达提高转基因植物的耐冷性。通过对酵母双杂交系统筛选到的候选互作蛋白进行初步分析表明,这些候选互作蛋白主要参与植物体的信号转导和非生物胁迫响应过程,表明Ta Di19A在植物的逆境信号转导及非生物胁迫响应过程中发挥着重要作用。【结论】小麦Ta Di19A受低温诱导表达,过表达能够提高转基因拟南芥的耐冷性;而Ta Di19A功能的发挥可能需要其他蛋白的参与。     

大豆GmLEA的分离及其在种子活力中的功能分析

【目的】大豆(Glycine max (L.) Merr.)种子从发育成熟期(R6或R7期)开始具有活力,在此时期容易受到高温高湿胁迫,导致种子活力下降。通过对Gm LEA的研究,揭示其高温高湿胁迫下的表达水平以及功能,为一步深入研究Gm LEA在参与大豆种子活力形成及响应非生物胁迫等方面奠定基础。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计引物,以宁镇1号和湘豆3号叶片的cDNA为模板,分离大豆GmLEA的cDNA序列全长。通过NCBI网站BLAST对GmLEA同源性氨基酸序列进行搜索,使用MEGA 6.0和DNAMAN多重比对蛋白质序列,并采用MEGA 6.0的N-J算法构建进化树。通过酵母双杂交试验验证GmLEA与GmCDPKSK5在酵母体内的互作。构建亚细胞定位和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)载体,通过基因枪介导法转化烟草叶片分析GmLEA与GmCDPKSK5在烟草叶片细胞内的互作及其编码蛋白的亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对GmLEA的组织特异性表达及其在高温高湿胁迫下的表达进行分析。构建pBI121融合表达载体,通过农杆菌介导法获得3个纯合的T3代过表达拟南芥株系,对高温高湿胁迫下拟南芥的种子活力进行分析。【结果】获得大豆GmLEA的cDNA序列全长,该基因包含一个长1 377 bp的开放阅读框(ORF);且该基因所编码的蛋白定位在烟草叶片细胞的细胞膜上。酵母双杂交试验与双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,GmLEA与GmCDPKSK5分别在酵母体内与烟草叶片细胞的细胞膜上存在特异性互作。组织特异性分析结果表明,GmLEA主要在宁镇1号和湘豆3号2个品种发育和成熟的种子中表达。在湘豆3号种子发育过程中Gm LEA的表达量呈先上升后下降的趋势,在开花后50 d达最大值,在宁镇1号种子发育过程中该基因的表达量呈上升的趋势,在开花后60 d达到最大值。高温高湿胁迫后,与对照相比,Gm LEA在湘豆3号中96 h时下调表达,其余时间点均上调表达,在宁镇1号中,仅24 h时下调表达。GmLEA过表达拟南芥株系经高温高湿胁迫后的发芽势、发芽率及种子活力均显著(P0.01)高于野生型植株。【结论】GmLEA参与高温高湿胁迫下种子活力的形成,与GmCDPKSK5存在特异性互作,二者可能共同参与高温高湿胁迫下种子活力的形成。     

大豆GmTIP1-1基因克隆及功能研究

[目的]本研究通过对大豆水通道蛋白基因GmTIP1-1的克隆及其在不同胁迫处理下的差异表达分析,探究水通道蛋白在大豆耐受非生物胁迫中的作用机制。[方法]从大豆品种‘天隆1号’中克隆出GmTIP1-1的CDS序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行分析。采用实时荧光定量PCR检测在不同逆境处理下GmTIP1-1在大豆根、茎、叶等组织的表达情况。利用基因枪轰击法对GmTIP1-1蛋白全长及不同跨膜结构域进行亚细胞定位分析。通过酵母双杂试验确定GmTIP1-1蛋白的互作蛋白,并利用实时荧光定量PCR检测在干旱处理下与GmTIP1-1互作蛋白基因的表达情况。[结果]GmTIP1-1的CDS序列全长为753 bp,编码250个氨基酸,等电点为6.51。系统进化分析发现,GmTIP1-1与苜蓿(Medicago truncatula)和黄瓜(Cucumis sativus)的亲缘关系十分相近。亚细胞定位结果显示,GmTIP1-1定位在细胞膜上。实时荧光定量PCR结果显示:GmTIP1-1在根中的表达量最高,在茎中次之,叶中最低;在干旱、ABA处理下均能诱导GmTIP1-1基因在大豆根、茎、叶中的表达;在干旱和ABA处理下,GmTIP1-1基因在根中的表达水平均高于在茎和叶中的表达水平。酵母双杂试验表明,GmTIP1-1与参与非生物胁迫调节的Gm SNARE蛋白以及响应逆境胁迫相关蛋白Gm F-box均存在互作。在干旱处理下,大豆根和茎中Gm SNARE和Gm F-box基因都会受到干旱诱导表达。[结论]GmTIP1-1蛋白定位于细胞膜,通过与参与非生物胁迫调节的Gm SNARE蛋白以及响应逆境胁迫相关蛋白Gm F-box互作来增强大豆对非生物胁迫的抗性。     

柽柳类锌指基因ThZFL的功能分析

为了研究柽柳ThZFL基因的功能,将ThZFL基因过表达转入烟草后,对转基因烟草进行盐胁迫、干旱胁迫,并利用酵母双杂交及染色体步移技术,获得柽柳ThZFL基因的互作蛋白与启动子。结果表明:柽柳ThZ-FL基因能显著提高转基因烟草盐胁迫下种子的发芽率、离体叶片的分化和植株的生长能力;通过酵母双杂交筛选出两个与ThZFL蛋白互作的蛋白;ThZFL基因启动子驱动GUS活性显示,在幼苗的整体、叶脉和毛状体中表达显著,但在幼叶和茎尖处表达微弱。     

GT和GATA转录因子对甘蓝型油菜BnA5.FAD2和BnC5.FAD2启动子功能的调控

【目的】脂肪酸去饱和酶2基因(FAD2)是控制油菜中油酸含量的重要基因,通过研究GATA和GT转录因子与BnA5.FAD2和BnC5.FAD2启动子的互作关系及其转录调控机制,为高油酸油菜育种提供分子理论基础。【方法】通过缺失启动子片段及生物信息学分析,预测BnA5.FAD2和BnC5.FAD2启动子区潜在顺式作用元件;从PlantTFDB转录因子数据库中筛选候选转录因子,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转录因子的表达规律,并与BnA5.FAD2和BnC5.FAD2表达规律对比,进一步筛选候选转录因子;利用酵母单杂交验证转录因子与启动子序列的互作情况;将转录因子与BnA5.FAD2和BnC5.FAD2启动子序列共转入拟南芥,通过Western blot检测报告基因GFP的蛋白表达情况,分析转录因子对于启动子功能的影响。【结果】单独敲除BnA5.FAD2和BnC5.FAD2启动子中的GT或GATA顺式作用元件后,GFP蛋白丰度均下降,表明GT和GATA顺式作用元件在调节基因转录中起重要作用。酵母单杂交结果显示,GATA家族转录因子(Bna010243-1、Bna026124-1和Bna026124-2)和GT家族转录因子(Bna010915和Bna013749)可以与BnA5.FAD2和BnC5.FAD2启动子相互作用。Western blot结果显示,当GATA家族转录因子与含有GATA元件的启动子片段共转化拟南芥时,GFP蛋白含量明显高于无转录因子时,当敲除GATA元件时,GFP蛋白含量无明显变化;当GT家族转录因子与含有GT元件的启动子片段共转化拟南芥时,GFP蛋白含量有明显变化,当敲除GT元件时,GFP蛋白含量无明显变化。【结论】GATA家族的转录因子Bna010243-1、Bna026124-1和Bna026124-2可以与BnA5.FAD2和BnC5.FAD2启动子中GATA元件相互作用,增强基因的表达水平。GT家族的转录因子Bna010915可以与BnA5.FAD2和BnC5.FAD2启动子中的GT元件发生互作,正向调节基因表达;Bna013749通过与BnA5.FAD2和BnC5.FAD2启动子中的GT元件发生互作,负向调节基因表达。     

大豆GmF-box基因植物表达载体的构建及转化拟南芥

为了研究大豆(Glycine max)Gm F-box基因的功能,以含有Gm F-box基因全长c DNA序列的p JET1.2-Gm F-box质粒为模板,通过PCR扩增获得Gm F-box基因的c DNA序列,并将该基因构建到植物表达载体p EGAD中,构建了由Ca MV35S启动子驱动Gm F-box基因的植物表达载体p EGAD-Gm Fbox,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染方法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。通过除草剂筛选和PCR检测转基因拟南芥,初步证明已获得转大豆Gm F-box基因的拟南芥。     

大豆（Glycine max）GmDREB5互作蛋白GmUBC13的特性及功能

【目的】鉴定大豆抗逆相关转录因子GmDREB5的互作蛋白,分析其互作蛋白GmUBC13的特性及其生物学功能,解析GmDREB5提高植物抗逆性的分子机制。【方法】通过酵母双杂交系统,以大豆GmDREB5的AP2功能域为诱饵对干旱处理的大豆cDNA文库进行筛选,获得GmDREB5候选互作蛋白后通过酵母互作及体外Pull-down试验确定GmDREB5与候选蛋白之间的互作关系;同时,分析互作蛋白GmUBC13的进化关系、蛋白结构及亚细胞定位等特性;通过半定量RT-PCR分析其互作蛋白GmUBC13在干旱、高盐、低温等非生物胁迫和激素ABA处理下的表达谱;通过转化烟草鉴定GmUBC13的生物学功能。【结果】通过筛选大豆干旱处理的cDNA文库获得一个GmDREB5互作蛋白GmUBC13（ubiquitin conjugating enzyme 13）,GmUBC13属于泛素结合酶蛋白家族,GmUBC13含有UBCc保守域（ubiquitin-conjugating enzyme catalytic domain）、与泛素连接酶E3互作的氨基酸残基以及高度保守的半胱氨酸催化位点。进化树分析表明,GmUBC13的氨基酸序列与拟南芥（Arabidopsis thaliana）含有16个成员的E2家族的第XV亚组的AtUBC13A、AtUBC13B以及水稻（Oryza sativa）的泛素结合酶蛋白Os01g0673600分别具有99%、97%和97%的同源性。酵母互作试验及体外Pull-down分析证明GmUBC13与GmDREB5蛋白之间存在相互作用。表达特性分析表明,GmUBC13受干旱、高盐、低温等非生物胁迫和激素ABA处理的诱导表达。GmUBC13在ABA的胁迫条件下,1 h开始有表达,10 h时表达量上升到最大,24 h稍微降低;在干旱和盐胁迫条件下,1 h开始表达,并随着胁迫时间的增长,表达量逐渐上升,24 h表达量达到最大;在低温胁迫条件下,GmUBC13受诱导较快,5 h表达达到最大,在10 h和24 h时未表达。蛋白亚细胞定位结果显示,GmDREB5蛋白定位在细胞核和细胞膜上,GmUBC13定位在细胞核中。基因功能鉴定结果证明,过表达GmUBC13的转基因株系GmUBC13-1、GmUBC13-2和受体对照W38的幼苗在正常MS培养基上的生长状态基本相似,在不同浓度PEG胁迫条件下,转基因株系GmUBC13-1、GmUBC13-2和W38烟草叶片叶绿素含量都降低,根长和地上部生长都受到抑制,而转GmUBC13烟草的叶片叶绿素含量降低缓慢,转基因烟草各株系的根长、地面长度均高于对照W38,且在8% PEG处理条件下,转基因株系GmUBC13-2的叶绿素含量、根长及地面长度与W38的差异达极显著。将生长2周的转基因烟草株系GmUBC13-1、GmUBC13-2与W38移至营养土中控水处理21 d,复水处理6 d后显示,转基因烟草株系生长情况明显优于非转基因对照W38,且转基因株系的存活率显著高于对照W38,表明在烟草中过表达大豆GmUBC13可以显著提高转基因烟草的抗旱性。【结论】大豆泛素连接酶GmUBC13与抗逆相关转录因子GmDREB5互作,GmUBC13受各种非生物胁迫处理诱导表达,在烟草中过表达可以显著提高植物的抗旱性。     

红肉苹果MdMKK9互作蛋白的筛选与鉴定

MKK9是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员之一，是在植物细胞响应外界胁迫信号转导中发挥重要作用的酶。为深入研究苹果MKK9的相关功能，以红肉苹果‘黛红’为材料，克隆到MdMKK9基因CDS序列，利用酵母双杂交试验筛选苹果cDNA文库，并通过酵母双杂交筛选、体内双分子荧光互补(BiFC)和体外Pull-down试验进行MdMKK9互作蛋白验证。结果表明，通过对苹果cDNA文库的筛选，共获得11个参与调控植物生长发育及应答逆境胁迫的候选互作蛋白；选取花青苷合成相关蛋白MdCHS及氮胁迫调控相关蛋白MdSPX3进行酵母双杂交、体内BiFC及体外Pull-down试验，结果证明MdMKK9可与MdSPX3互作。     

不结球白菜开花基因BcFT的亚细胞定位及其互作蛋白的筛选

[目的]开花基因FT是开花通路下游关键基因。本文旨在研究不结球白菜BcFT的亚细胞定位及互作蛋白的筛选,深入了解不结球白菜BcFT的功能及其调控机制。[方法]构建亚细胞定位载体p EZS-NL-BcFT,利用亚细胞定位技术研究BcFT的空间表达。通过酵母双杂交技术筛选与BcFT互作的蛋白,构建酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-BcFT,转化酵母Y2H Gold菌株,验证自激活性和自毒性。对不结球白菜酵母双杂交c DNA文库进行筛选,得到与BcFT互作的片段,并根据基因片段进行比对,以不结球白菜c DNA为模板进行基因全长克隆,构建p GADT7载体,进行共转化验证,最后对筛选得到的2个蛋白进行生物信息学分析。[结果]BcFT蛋白在整个细胞中均有分布。诱饵载体p GBKT7-BcFT表达产物对酵母细胞无自激活性和自毒性,通过酵母双杂交及共转验证得到2个与BcFT互作的蛋白:Bc PPD5和Bc VHA-E1。生物信息学分析预测这2个蛋白均为亲水性蛋白,不含信号肽,Bc PPD5蛋白的氨基酸序列存在1个跨膜区,二级结构中不规则卷曲所占比例最大,第163和296氨基酸残基之间存在1个Psb P结构域;Bc VHA-E1蛋白无跨膜区,二级结构中α螺旋所占比例最大,无特定结构域。[结论]确定了BcFT蛋白在整个细胞中均有表达。利用酵母双杂交技术筛选得到2个与BcFT互作蛋白,进一步分析发现其可能通过光周期路径影响开花。     

苹果MdJAZ1基因表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果茉莉酸信号途径阻遏因子基因MdJAZ1,并对其表达及蛋白互作进行分析,为进一步研究MdJAZ1的功能奠定基础。【方法】以TIFY及Jas功能域为探针,在苹果基因组中进行比对,获得多个同源基因,对其中的一个基因设计引物进行克隆;利用DNAMan软件对该基因编码蛋白的分子量、等电点进行预测;利用SMART在线分析软件对该蛋白的功能域进行分析;利用MEGA5.0对该蛋白与拟南芥JAZ家族蛋白构建系统发育树;利用荧光定量PCR分析该基因在苹果不同组织器官、茉莉酸甲酯及创伤处理下的表达情况;利用PlantCARE在线软件分析该基因启动子区域的顺式作用元件;利用酵母双杂交系统检测MdJAZ1蛋白的二聚化及其与拟南芥AtCOI1蛋白的互作关系。【结果】MdJAZ1开放阅读框为1 149 bp,编码382个氨基酸残基,其蛋白的分子量为40.536 kDa,等电点9。氨基酸序列分析显示,该蛋白包含保守的TIFY及Jas结构域;系统发育树分析显示,MdJAZ1蛋白与拟南芥JAZ家族AtJAZ3、AtJAZ4亲缘关系最近;qPCR结果显示,MdJAZ1在苹果的根、茎、叶、花及果实等组织中都有表达,但表达水平存在明显差异,其中根中的表达量最高,果实中的表达量最低;该基因还能被茉莉酸甲酯及创伤处理诱导表达,均在1 h内达到最高表达水平;启动子分析显示,MdJAZ1启动子中包含多个ABA、乙烯、抗病及逆境胁迫等响应元件,此外,还包含多个MYB结合位点;酵母双杂交结果显示,MdJAZ1蛋白能与其自身相互作用形成同源二聚体,还可与拟南芥中同源性较近的AtJAZ3、AtJAZ4蛋白相互作用形成异源二聚体,并且在冠菌素存在时,MdJAZ1蛋白可与拟南芥F-box蛋白AtCOI1相互作用。【结论】MdJAZ1受茉莉酸甲酯及创伤诱导表达,其蛋白能形成同源及异源二聚体,且在冠菌素存在时可与AtCOI1互作。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4启动子结构与活性分析

【目的】克隆GmPAP4启动子(PAP4-pro),并分析其表达特性,为进一步研究其作用机制奠定基础。【方法】依据GmPAP4 c DNA序列(Gen Bank No.HQ162477),通过比对大豆参考基因组,设计特异引物,克隆GmPAP4启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测该启动子相关调控元件。构建GmPAP4启动子驱动GUS表达载体(PAP4-pro-GUS)并转化根癌农杆菌GV3101;通过Floral dip法将PAP4-pro-GUS转化拟南芥,利用卡那霉素(Kan)抗性筛选和特异引物的PCR鉴定,最终获得T3转基因拟南芥。通过对T_3转基因拟南芥不同组织GUS染色,分析启动子的组织表达特性,将T3转基因拟南芥通过适磷和植酸磷处理,20 d后,取其根部进行GUS活性和表达分析,研究启动子对不同磷环境的响应。【结果】克隆了GmPAP4上游启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测显示,GmPAP4启动子除含有启动子核心的调控元件外,还含有(1)组织特异调控元件:as1(根系特异表达调控元件)和Skn-1_motif(胚乳特异表达调控元件);(2)应答元件:TC-rich repeats(逆境胁迫反应调控元件)和Box-W3(真菌应答相关调控元件);(3)结合位点:MBS(MYB转录因子的结合位点)等。不同组织GUS染色结果显示,转基因拟南芥整个根系GUS染色较深,茎、叶中仅微管组织有较明显GUS染色,花瓣微管组织中也能观察到微弱GUS染色。定量PCR结果显示,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS表达比适磷处理提高了1.3倍(P0.05);同时GUS活性测定显示,与适磷处理相比,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS活性提高了1.9倍(P0.05)。【结论】获得大豆GmPAP4启动子,通过不同组织GUS染色和不同磷环境GUS表达分析显示该启动子主要在根部且受低磷信号诱导表达,为诱导型启动子。     

小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选

 【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转导以及生长发育等相关的候选蛋白。【结论】筛选得到候选蛋白的功能预测表明TaDREB6可能参与了多条信号转导途径,在抗逆境调控中具有重要作用。     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。     

拟南芥转录因子AtMYB73转录活性区域分析及互作蛋白的筛选

【目的】确定拟南芥抗逆转录因子AtMYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白,为进一步阐明AtMYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。【方法】构建转录因子AtMYB73的酵母诱饵表达载体pAS1-AtMYB73,检测pAS1-AtMYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。克隆AtMYB73的N端区域（含有R2R3结构域）和C端区域（不含R2R3结构域）,检测AtMYB73的N端和C端的转录激活活性,分析AtMYB73自激活结构域的位置。利用酵母双杂交技术,以AtMYB73为诱饵筛选拟南芥的cDNA文库,将阳性克隆进行鉴定、测序;利用TAIR数据库对筛选获得的AtMYB73的候选互作蛋白进行分析。构建AtMYB73和F12F1.4的酵母双杂交载体pGBDT7-AtMYB73和pGADT7-F12F1.4,通过酵母双杂交技术,对其互作关系进行分析。【结果】含pAS1-MYB73的酵母菌在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp/、SD/-Ade/-Trp培养基上均能生长,表明AtMYB73具有较高的自激活活性。含pAS1-AtMYB73的酵母菌在SD/-Trp/Amp液体培养基中培养24 h的OD₆₀₀值大于0.8,表明诱饵载体对酵母Y190没有细胞毒性。成功构建了pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C载体,获得了含有pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C的酵母;含pAS1-AtMYB73-N的酵母在含X-a-gal的YPAD培养基上呈现无色,而含pAS1-AtMYB73-C的酵母则呈现蓝色,表明AtMYB73的C端有明显的自激活性,而N端没有自激活性。以AtMYB73为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库,获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个蛋白。利用酵母双杂交技术,确定了MYB73与F12F1.4之间存在一定的互作。【结论】拟南芥抗逆转录因子AtMYB73具有较高的转录激活活性,其活性区域位于C端;以AtMYB73为诱饵,筛选获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个AtMYB73的候选互作蛋白;利用酵母双杂交技术,确定了AtMYB73与F12F1.4之间的互作关系。     

葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2互作蛋白筛选与鉴定

【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子VvRR2,获得VvRR2的互作蛋白,为阐明VvRR2在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌,提取总RNA后反转录,利用实时荧光定量PCR检测VvRR2转录本对白粉病菌的响应;构建瞬时表达载体pBI221-VvRR2-GFP,转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析;构建酵母表达载体pGBKT7-VvRR2,转化酵母菌株AH109,检测VvRR2的转录激活活性;构建酵母表达cDNA文库,以VvRR2为诱饵,通过Mating法筛选互作蛋白,对获得候选序列进行Blast分析;将候选蛋白VvTGA的全长序列克隆至pGADT7载体形成重组载体pGADT7-VvTGA,与重组诱饵载体pGBKT7-VvRR2共转化酵母,进行双杂交验证VvRR2与VvTGA的相互作用;将VvTGA的全长序列克隆至pSPYNE（R）173载体,形成重组载体pSPYNE-VvTGA,将VvRR2的全长序列克隆至pSPYCE（M）载体,形成重组载体pSPYCE-VvRR2,然后将两个重组载体共转化拟南芥原生质体,利用双分子荧光互补技术验证VvRR2与VvTGA的相互作用。【结果】葡萄接种白粉病菌后,细胞分裂素响应调节因子VvRR2呈现受白粉病菌诱导表达模式。VvRR2定位在拟南芥原生质体的细胞核,转录激活试验结果表明VvRR2在酵母体内具有转录激活活性。在含有60 mmol·L^-1的3-AT培养基上可以抑制VvRR2诱饵载体的自激活活性,VvRR2诱饵载体对宿主酵母菌没有毒性。以VvRR2为诱饵,初步筛选到287个单克隆,在高严谨条件下进一步筛选获得23个有效序列,Blast分析显示这些基因参与蛋白质合成与降解、细胞分裂素信号传导、光反应和生物钟节律、生长发育和逆境响应。酵母回复双杂交试验结果显示含有空载体（pGADT7或pGBKT7）酵母在四缺培养基（含3-AT）上不能生长,含有两种重组质粒的酵母在四缺培养基（含3-AT）上能够生长,并在含有X-α-Gal的四缺培养基上能够显色。双分子荧光互补试验结果显示共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE（R）173、pSPYNE-VvTGA与pSPYCE（M）的原生质体没有黄色荧光,而共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE-VvTGA的原生质体显示黄色荧光。VvTGA的表达类似于VvRR2,呈现受白粉病菌诱导表达模式。【结论】葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2是一个受白粉病菌诱导表达的转录因子,能够与VvTGA相互作用,并且VvTGA受白粉病菌诱导表达。     

利用酵母双杂交筛选与苹果褪绿叶斑病毒CP互作的寄主因子

【目的】利用酵母双杂交系统筛选与苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV）外壳蛋白（coat protein, CP）互作的寄主因子,利用生物信息学方法分析其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用。【方法】首先构建ACLSV CP的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP,转化至酵母菌株Y2H gold中,测定转化菌在SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade-X-α-Gal平板上的生长情况,从而判断其在酵母双杂交过程中对报告基因的自激活活性。将pGBKT7-CP及pGBKT7分别转化至酵母菌株Y2H gold,培养不同时间后,用紫外分光光度计测定OD₆₀₀值,分析pGBKT7-CP对酵母菌生长的影响;然后通过顺序转化的方法自前期已构建好的苏俄苹果（Malus sylvestris cv. R12740-7A）cDNA文库中钓取与ACLSV CP互作的因子,最终在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上筛选生长良好的蓝色阳性菌落,测定序列,并在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用。【结果】成功构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP,转化至酵母菌株Y2H gold后,转化菌只能在SD/-Trp平板上正常生长,不能在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade-X-α-Gal平板上生长,表明重组质粒自身不能激活报告基因His及Ade的表达,没有自激活活性。酵母双杂诱饵载体pGBKT7-CP与对照空质粒转化菌生长情况相似,证明诱饵载体对酵母菌没有毒性;筛选到了69个互作寄主基因,包括转录因子活性、碳固定活性、细胞内铁离子平衡、防御反应、水解酶活性、氧化酶活性、氧化还原酶活性、光系统II组件、绑定蛋白等10类蛋白,经生物信息学分析,其中8个寄主基因（Malus3-1、Malus4-2、Malus4q1、Malus31-3、Malus49q2、Malus15-1、Malus6-2、Malus91-4）可能在病毒与寄主互作过程中起重要作用。【结论】分析筛选到的重要寄主蛋白功能,推测ACLSV CP与BZIP类、MYB类转录因子、病程相关蛋白（PR-5、PR-8、PR-10）互作,可能调控了寄主对病毒的抗性作用;与光系统II（PSII）的稳定性/装配因子蛋白、铁结合蛋白互作,影响植物光系统的稳定性及叶绿素的形成,从而降低光合作用。这将为揭示ACLSV导致寄主产生褪绿叶斑及树体衰退的原因提供理论依据。     

谷子转录因子基因SibZIP42在拟南芥中对高盐和ABA的响应

【目的】分析谷子抗逆相关转录因子基因Sib ZIP42的特性和生物学功能,探讨Sib ZIP42提高植物耐盐性的调控途径,为作物抗逆分子育种提供新的候选基因。【方法】利用生物信息学方法分析谷子Sib ZIP42的特性:使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05软件对谷子Sib ZIP42蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建系统进化树;从数据库Phytozome获取谷子Sib ZIP42上游2 000 bp作为启动子序列,在PLACE数据库对Sib ZIP42启动子顺式作用元件进行分析;使用Net Phos 2.0 Server数据库预测Sib ZIP42蛋白磷酸化位点;利用实时荧光定量PCR检测Sib ZIP42在不同胁迫条件下的表达模式;将Sib ZIP42与绿色荧光蛋白GFP融合表达,检测Sib ZIP42蛋白的亚细胞定位情况;构建植物表达载体p BI121-Sib ZIP42,转化拟南芥并检测转Sib ZIP42拟南芥的耐盐性及对ABA处理的敏感性。分析转Sib ZIP42拟南芥中ABA及脱水响应相关基因表达变化,分析Sib ZIP42调控植物耐盐性的作用机制。【结果】谷子Sib ZIP42全长546 bp,编码由181个氨基酸组成的亲水性蛋白,分子量约为20.3k D,基因编码区包含1个外显子;系统进化树分析表明该基因位于b ZIP基因家族的S亚组;Sib ZIP42与拟南芥Atb ZIP42序列同源性最高;启动子元件分析表明,Sib ZIP42包含ABRE、MYB、MYC等多种逆境胁迫应答相关元件;磷酸化位点分析结果显示Sib ZIP42含有14个丝氨酸、4个酪氨酸和1个苏氨酸磷酸化位点;实时荧光定量PCR结果显示,Sib ZIP42对多种非生物胁迫均有不同程度的响应,在高盐、干旱(PEG)和ABA处理条件下表达量明显上升,Sib ZIP42在根部的表达量显著高于在茎及叶子中的表达;亚细胞定位结果表明,Sib ZIP42蛋白定位于细胞核中;基因功能分析结果显示,在正常MS培养基上,野生型拟南芥WT和Sib ZIP42转基因拟南芥的萌发率基本一致,在Na Cl浓度为90、120和150 mmol·L~(-1)的MS培养基上,转基因拟南芥萌发率显著高于WT,在90 mmol·L~(-1) Na Cl处理条件下,转基因拟南芥的绿化率显著高于WT;在ABA浓度为0.5、1和2μmol·L~(-1)的MS培养基上,转基因拟南芥的绿化率显著低于WT;下游基因检测结果表明,HIS1-3、RD29B和RAB18等ABA胁迫响应相关基因以及脱水响应相关基因At PIP2A在转基因植株中表达量显著高于在WT中的表达,表明Sib ZIP42可能通过ABA信号途径提高植物对高盐胁迫的耐性。【结论】与WT相比,Sib ZIP42转基因拟南芥株系在种子萌发时期耐盐性显著提高。同时,在种子萌发后期Sib ZIP42转基因株系相比于WT对ABA处理的敏感性增强,Sib ZIP42可能通过ABA信号途径正向调控植物的耐盐性。     

人源肺细胞cDNA文库构建及与流感病毒NP互作宿主蛋白的筛选

【目的】构建肺组织细胞Calu-3及A549的高质量酵母cDNA文库并筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子,为深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Calu-3及A549细胞的总RNA,混合后反转录生成cDNA,利用长距离PCR(LD-PCR)扩增合成dscDNA,用CHROMA SPINTM+TE-400纯化柱纯化dsDNA,按照Clontech公司的Make Your Own"MatePlate"Library System操作程序,将带有同源臂的dscDNA与线性化p GADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞,涂布SD/-Leu平板后于30℃培养4d左右,收集所有菌落,混匀分装即为Calu-3和A549细胞cDNA的酵母文库,并对文库库容、滴度及多样性进行分析。利用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切将A/Auhui/2/2005(H5N1)NP定向插入pGBKT7载体,构建高致病性流感病毒NP的诱饵质粒p GBKT7-NP,经验证该质粒无自激活活性,并进一步采用构建完成的Calu-3/A549细胞酵母文库进行杂交筛选,筛选得到的正确阅读的猎物质粒与诱饵质粒共转Y2H Gold酵母菌,分别以BD-P53/AD-T7作为阳性对照和BD-Lam/AD-T7作为阴性对照,挑取最终在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/Aro A(SD/-4/X/A)固体培养板上生长良好且变蓝的菌落,即为候选与目标蛋白互作阳性的蛋白,提取酵母质粒,进行测序分析、序列比对和Gene Ontology分析。【结果】提取两种细胞RNA 28S与18S条带清晰,5S条带暗淡,表明所提RNA质量较高,基本无降解;对提取的RNA反转录纯化获得dscDNA,dscDNA条带呈弥散状,片段大小分布于500—2 000bp之间,说明不同丰度及大小的RNA均成功反转录;构建的dscDNA文库库容为1.5×10~7,滴度为2.2×10~8cfu/m L,重组率为88%,PCR鉴定文库插入片段,条带大小不一、多样性好;利用诱饵质粒与文库进行双杂交筛选,回交验证后得到11个与NP蛋白互作的宿主因子。经Gene Ontology分析显示,11个宿主因子参与的生物过程包括:细胞凋亡、胚胎发育、可变剪接、转录调节及细胞增殖等;涉及的分子功能包括:GTP结合活性、金属离子结合活性、DNA结合活性及转录因子活性。【结论】成功构建同时含有Calu-3和A549两种人源肺细胞cDNA的酵母文库,文库覆盖cDNA更全面,为后期筛选与流感病毒其它蛋白互作的宿主蛋白奠定基础,筛选得到与NP蛋白存在相互作用的宿主因子为进一步深入研究NP功能提供了可靠的前期数据。