应用SELDI-TOF-MS技术对患脂肪肝奶牛血浆差异蛋白的分离鉴定及生物信息学特征

【目的】脂肪肝是围产期奶牛主要代谢性疾病之一,50%产后奶牛受其影响。产后奶牛生产力降低、繁殖性能低下、免疫功能减弱、肝功能衰竭和过早死亡都与脂肪肝有关。表面增强激光解析/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)是一种对生物样本蛋白质研究的新型高敏感性蛋白质组学方法,文章旨在探讨脂肪肝奶牛血浆蛋白质组学特征。【方法】于黑龙江某集约化养牛场选择产后7—28d,1—2胎次荷斯坦奶牛40头。清晨空腹尾静脉采血10m L,应用肝素抗凝(150U)迅速离心(3 000 r/min,5 min)分离血浆,置于-80℃冰箱冷冻保存。依据血浆甘油三酯(TG0.20 mmol·L-1),血浆β-羟丁酸(BHBA1.2mmol·L-1)浓度和临床症状,将其分为试验组(T)20头和健康对照组(C)20头。应用SELDI-TOF-MS技术测得血浆蛋白质谱,利用Ciphergen Protein Chip Software(Version 3.1.1)对在试验组和对照组所有样品中得到的峰图进行分析,得到原始数据。将两组之间的数据峰值做wilcoxon sum rank test统计检验,用计算出的P值判断峰在两组中是否有显著差异。以0.01作为P值的阈值,筛选出P值小于0.01的差异峰。在得到的差异峰中,将差异峰的m/z值与Swissport蛋白数据库中多肽的理论荷质比(mass to charge ratio,m/z)进行比较,找到最相似的蛋白作为差异峰可能检测蛋白的预测结果。【结果】与对照组相比,试验组奶牛血浆蛋白质谱存在39个差异峰,在得到的39个差异峰中,将差异峰的m/z值与Swissport蛋白数据库中多肽的理论荷质比值进行比较,最终获得26个可预测的差异峰,预测蛋白11种。结果显示,相对于C组,11种预测蛋白在T组中均表达下调。通过生物信息学(Network,GO,Pathway)分析,应用Cytoscape软件对获得的11种蛋白进行牛类基因网络搜索,得到Networks分析结果图。在数据库中搜索到了试验结果中的淀粉样肽前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)和纤维蛋白原α链(fibrinogen alpha chain,FGA)两种差异蛋白,并得到其相关的Networks分析结果。应用Cytoscape软件中Bin GO插件对11种蛋白进行GO分析,并得到GO分析结果。对这些蛋白质经软件搜库得到已经注释的差异蛋白有9种,分别为FGA、血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein,SAA)、血浆蛋白酶c1抑制剂(plasma protease c1 inhibitor,SERPING1 or C1INH)、血清载脂蛋白-CⅢ(apolipoprotein c-Ⅲ,Apo CⅢ)、海帕西啶(hepcidin,HAMP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN or SPP1)、甲状腺素运转蛋白(transthyretin,TTR)、胱蛋白酶抑制剂C(cystatin-c,CysC or CST)、神经分泌血管生长因子蛋白(neurosecretory protein,VGF)。应用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway数据库搜索。搜索结果显示只有6种蛋白质可在数据库中搜到,分别是FGA、SERPING1、APO-CⅢ、APP、CysC、SPP1。并得到其相关的Pathway分析结果。这些蛋白可能是与奶牛脂肪肝发病机制相关的物质。【结论】应用SELDI-TOF-MS技术有效的分离了健康牛与患病牛之间的血浆差异表达蛋白,均在肝脏代谢或脂肪肝疾病发生发展过程中起重要的调节作用,对探究奶牛脂肪肝发病机理及其对机体生物学功能的影响具有重要的理论价值。差异蛋白对奶牛脂肪肝的发病机理的影响尚待进一步研究。     

飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析

 【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白Obstructor（Obst）家族基因的cDNA序列,并研究其序列特征和mRNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因cDNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的cDNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列,拼接后获得全长;SignalP在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇（Drosophila melanogasterObst家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneumCPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析;采用real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测LmObst家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况,绘制表达图谱））;采用RNA干扰（RNAi）技术探讨LmObsts对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段,通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇Obst高度同源,属于LmObst家族基因片段,其中5个是全长序列,3个序列缺失3′端;采用RACE技术获得3′末端cDNA序列;将得到的8个LmObst家族基因全长序列进行功能域分析,发现具有Obst家族表皮蛋白的特点,即有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建,根据进化树分析结果,分别命名为LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。qPCR结果显示LmObst-E1和LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达,LmObst-D1在体壁和前肠高表达,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达;LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近,在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能,5龄若虫第5天分别注射dsLmObst,对照组注射等量dsGFP,48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低;进一步观察发现,注射dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20% 若虫蜕皮延迟1-2 d,并且蜕至成虫后,16 h内全部死亡;其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗LmObst家族基因,所有Obst家族蛋白功能域保守,均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;LmObsts主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡,其他7个LmObsts的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d,但无致死效应。     

中国主要土壤有效磷演变及其与磷平衡的响应关系

【目的】明确土壤有效磷的演变规律及其与磷平衡(土壤磷输入减去磷输出)的响应关系,为指导磷肥施用以及管理有效磷水平提供依据。【方法】选取21个农业部国家耕地质量长期监测点,分析常规施肥条件下中国主要5种类型土壤上有效磷的演变规律与土壤磷素的平衡状况,得到单位磷平衡的有效磷变化量（即有效磷效率）,同时对土壤的有效磷效率与土壤性质（pH、有机质、全氮和碱解氮）进行相关性分析。【结果】21个土壤监测点中有2个点的磷素出现耗竭,19个点的磷素出现累积,累积磷盈亏在-290-4 919 kg?hm^-2。在监测时间内,有14个监测点的有效磷随年份显著上升,2个监测点显著下降,其余持平。21个监测点的有效磷年均上升0.74 mg?kg^-1。81%的土壤监测点有效磷与磷平衡呈显著的正相关关系,土壤每累积100 kg P?hm^-2,褐土有效磷平均增加1.12 mg?kg^-1,变异系数为25%;黑土有效磷增加3.76 mg?kg^-1,水稻土有效磷平均增加5.01 mg?kg^-1,变异系数为52%;紫色土有效磷平均增加2.34 mg?kg^-1,变异系数为68%;灌淤土有效磷增加0.47 mg·kg^-1。有效磷效率与土壤pH呈显著的直线负相关关系（r=0.65,P＜0.01）,与土壤有机质（r=0.62,P＜0.01）、全氮（r=0.52,P＜0.01）和碱解氮（r=0.63,P＜0.01）呈显著的直线正相关关系。【结论】中国主要类型土壤的有效磷效率有一定差异,范围在0.47-10.76 mg?kg^-1,有效磷效率均值在不同土类之间为水稻土＞黑土＞紫色土＞褐土＞灌淤土,且土壤pH、有机质、全氮、碱解氮与土壤有效磷效率呈显著的直线相关关系。     

番荔枝花器官发育基因AsAG的克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】从番荔枝中分离花器官特征决定基因AGAMOUS,并进行亚细胞定位及基因表达分析,为进一步研究该基因参与调控花发育调控的分子机理,及解决番荔枝花发育异常问题奠定基础。【方法】以番荔枝成熟花为材料,通过试剂盒提取总RNA,并以RACE方法克隆获得基因AG的全长序列。序列拼接和氨基酸序列分析采用DNAMAN软件;相似性分析通过BLASTn和BLASTp程序进行;进化树构建采用MEGA 5.1软件;蛋白质二级结构预测与3D结构建模分别采用ExPaSy的SOPMA和Phyre2程序进行;亚细胞定位表达采用烟草上皮细胞瞬时转染系统和基因枪轰击洋葱表皮细胞方法;AG在花发育不同时期、不同器官及不同激素信号分子处理下的表达特性分析,利用实时荧光定量RT-PCR方法。【结果】从番荔枝中克隆得到AGAMOUS,其cDNA全长ORF序列长度为669 bp,编码222个氨基酸,命名为AsAG,序列提交到GenBank（登录号为KT159768）。二级结构预测发现AsAG所编码蛋白由延伸链结构（俄extended strand）、α-螺旋（alpha helix）、β-转角（beta turn）和不规则卷曲（random coil）组成,四者比例分别为14.41%、59.46%、8.11%和18.02%。生物信息学分析显示AsAG编码的蛋白与海枣（XP 008781978.1）、芦笋（BAD83772.1）、拟南芥（AT4G18960）、油棕（XP 010912706.1）、山玉兰（AFH74390.1）、石斛（ABQ08574.1）、红花玉兰（AEO52692.1）等同源蛋白的相似度达79%-84%。ASAG蛋白含有一个高度保守的MADS-box结构域和一个次级保守的K区,该蛋白分子量为25.7 kDa,等电点为9.15,为稳定蛋白,无信号肽。亚细胞定位显示AsAG编码蛋白定位于细胞核。实时定量RT-PCR结果表明,AsAG在不同的器官中表达量存在差异,在花中表达量最高。AsAG在番荔枝花发育的整个过程中都有表达,而在花蕾期Ⅳ中表达量最高。进一步分析发现AsAG的表达水平呈现花器官特异性分布（雄蕊＞雌蕊＞萼片＞花瓣）。进一步研究表明,AsAG在畸形花中的表达量低于正常花。检测GA和ABA等不同信号分子分别处理番荔枝花芽2 h和4 h后AsAG的表达量,结果表明AsAG的表达受GA负调控,受ABA正调控。【结论】推测番荔枝AsAG可能参与雌蕊和雄蕊的发育及激素信号的响应。     

不同蛋白来源对京红蛋鸡生产性能及蛋品质的影响

【目的】营养素来源对动物生产性能和产品品质的影响是动物营养研究的关注热点之一,文章旨在探讨蛋白来源对高峰期产蛋鸡生产性能及蛋品质的影响。【方法】选取288 只32 周龄京红1号产蛋鸡,分别饲喂以豆粕、脱酚棉籽蛋白、双低菜粕、豆粕+4%黄粉虫为蛋白来源的4种日粮,每个处理6 个重复,每个重复12 只鸡。试验日粮在等能、等氮、相同标准回肠可消化氨基酸模式基础上配制。试验期内蛋鸡自由采食和饮水,光照时间16L﹕8D,相对湿度50%-60%,舍温（16±2）℃,试验期8 周。【结果】（1）试验期全期,各处理组的产蛋率、平均蛋重和软破蛋率无显著差异（P＞0.05）;与豆粕组相比,棉籽蛋白组的日产蛋量显著降低（P＜0.05）,双低菜粕组有降低趋势（P=0.084）,4%黄粉虫组无显著差异（P＞0.05）;棉籽蛋白组和4%黄粉虫组的日采食量低于豆粕组（P=0.091）,双低菜粕组的日采食量高于豆粕组（P=0.091）;相对于豆粕组,棉籽蛋白组和双低菜粕组的饲料效率有降低趋势（P=0.052）,4%黄粉虫组无显著变化（P＞0.05）。（2）不同蛋白来源对产蛋鸡血浆谷草转氨酶（AST）活性无显著影响（P＞0.05）;8 w末时,与豆粕组相比,4%黄粉虫组的血浆谷丙转氨酶（ALT）活性显著降低（P＜0.05）,棉籽蛋白组蛋鸡血浆总蛋白（TP）和球蛋白（GLB）显著降低（P＜0.05）;4 %黄粉虫组TP、白蛋白（ALB）和GLB与豆粕组相比无显著性差异（P＞0.05）;4、8 w末时,4%黄粉虫组ALB显著高于棉籽蛋白组和双低菜粕组（P＜0.05）。（3）8 w末,与豆粕组相比,棉籽蛋白组和双低菜粕组的蛋壳强度（P=0.084）、蛋壳厚度（P=0.062）均有降低趋势,而4%黄粉虫组均有提高趋势。4 w末,与豆粕组相比,棉籽蛋白组和双低菜粕组蛋白高度分别降低4.02%、3.41%（P=0.091）,4%黄粉虫组提高3.87%（P=0.079）;试验期内各处理组蛋白pH均无显著差异（P＞0.05）。（4）4 w末,与豆粕组相比,棉籽蛋白组和双低菜粕组的蛋清比例分别降低1.67%和1.18%（P=0.099）,4%黄粉虫组提高1.70%（P=0.099）;4%黄粉虫组蛋黄干物质含量显著高于菜粕组（P＜0.05）。【结论】对于京红1号高峰产蛋鸡而言,在日粮等能、等氮、相同可消化氨基酸模式下,棉籽蛋白和双低菜粕可降低日产蛋量,降低日采食量和饲料效率,同时降低蛋白高度及哈氏单位等。可见,豆粕及4%黄粉虫部分替代豆粕较适合作为其蛋白源饲料,双低菜粕和脱酚棉籽蛋白稍次。     

GmHMADP参与高温高湿下大豆种子活力形成及铜镉胁迫响应的研究

【目的】高温高湿、重金属等非生物胁迫是制约大豆生产,影响种子发育和品质的重要因素。通过对大豆GmHMADP的研究,揭示其在重金属镉、铜和高温高湿胁迫下的表达水平以及功能,以期为培育高活力的逆境耐受性大豆新品种提供理论依据和实践基础。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计引物,以宁镇1号和湘豆3号2个品种叶片的cDNA为模板,分离大豆GmHMADP全长cDNA序列。通过NCBI网站BLAST对GmHMADP同源性氨基酸序列进行搜索,并用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对。同时,以XhoⅠ和SalⅠ为酶切位点构建35S::GmHMADP-GFP融合表达载体,分析其在烟草叶肉细胞的瞬时表达,进行亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR技术对GmHMADP的组织特异性表达及其在高温高湿和CuSO₄、CdCl₂处理下的表达进行分析。以XbaⅠ和BamHⅠ为酶切位点,利用pBI121载体,构建融合表达载体,将GmHMADP在野生型拟南芥中过表达,获得3个纯合的T3转基因株系,对高温高湿胁迫下拟南芥的种子活力以及过表达拟南芥植株对铜、镉胁迫的耐受性进行分析。【结果】获得大豆GmHMADP全长cDNA序列,该基因包含1个996 bp的完整开放阅读框,具有4个外显子和3个内含子。多序列比对结果表明,GmHMADP氨基酸序列含有2个金属离子结合位点特征序列CXXC。亚细胞定位结果表明GmHMADP蛋白定位于细胞膜与细胞核上。组织特异性分析结果表明,GmHMADP在宁镇1号和湘豆3号2个品种的发育和成熟中的种子中表达量较高。与相应的对照组相比,在宁镇1号种子中,高温高湿胁迫48、96和168 h后,GmHMADP的表达量显著（P ＜0.01）升高;在抗性品种湘豆3号中,该基因在处理24、48、96和168 h时表达量显著（P ＜0.01）升高;湘豆3号中,GmHMADP的表达量在不同浓度Cu²⁺、Cd²⁺的诱导下均显著（P ＜0.01）升高;而宁镇1号中,GmHMADP的表达量仅在50 μmol·L^-1 Cu²⁺和200 μmol·L^-1 Cd²⁺处理下显著（P＜0.01）升高。GmHMADP过表达拟南芥株系经高温高湿胁迫后的发芽势、发芽率及种子活力均显著（P＜0.01）高于野生型植株;经Cu、Cd胁迫后,转基因拟南芥株系的根长和干重均显著（P＜0.05）高于野生型植株。【结论】GmHMADP参与高温高湿胁迫下种子活力的形成并响应Cu、Cd胁迫,在拟南芥中过表达GmHMADP可提高拟南芥的种子活力以及对Cu、Cd胁迫的耐受性。     

乌珠穆沁绵羊RIPK2基因多态性与生长性状的关联

【目的】基于前期绵羊肉用性状GWAS研究结果,旨在探讨RIPK2基因对乌珠穆沁绵羊生长性状的影响,找到该基因中与绵羊生长性状相关的分子标记,同时对GWAS结果进行验证。【方法】在343只乌珠穆沁绵羊试验群体中,选取其中30个个体的血液DNA样本,以相同浓度组成池DNA,设计引物对RIPK2基因外显子及其上下游1 000bp的调控区进行PCR扩增,PCR产物检测为目的条带后测序。使用DNAMAN和Chromas2软件对测序峰图进行分析,采用飞行质谱方法对检测到的SNP位点及前期GWAS得到的SNP位点进行基因型分型。使用Haploview软件对多态位点构建单倍型及连锁不平衡分析。使用SPSS （22.0）软件进行RIPK2基因SNP位点与生长性状间的关联分析。【结果】共发现了4个多态位点,A5536G的同义突变rs01位于第四外显子内,在该位点检测到三种基因型,AA基因型频率为0.42,AG基因型频率为0.45,GG基因型频率为0.13,优势等位基因为A,其频率为0.65;在第七外显子上检测到T8952C错义突变rs02,在该突变位点检测到3种基因型,其中TT基因型频率为0.82,TC基因型频率为0.16,CC基因型频率为0.02,T为优势等位基因,基因频率为0.9;在第十外显子检测到 T2836C的突变rs05,在该位点检测到两种基因型TT和CC,没有检测到杂合子基因型,TT基因型频率为0.25,CC基因型频率为0.75;上游调控区发现一个G5181C的突变rs30,有3种基因型,其中GC基因型频率为0.50,CC基因型频率为0.18,GG基因型频率为0.32,G为优势等位基因,其频率为0.58; GWAS得到的SNP位点是T4456C,在本研究中被命名为rs34,在该位点有3种基因型,其中TT基因型频率为0.49,TC基因型频率为0.37,CC基因型频率为0.14,优势等位基因T的频率为0.68。χ²适合性检验发现,除rs34位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。rs02位点处于低度多态(PIC＜0.25),其余位点处于中度多态(0.25＜PIC＜0.5)。连锁不平衡分析发现,rs01和rs02位点强连锁,在群体中共构建了3种单倍型,AT 为优势单倍型,其频率为0.645,这两个位点共构建了6 种基因型组合,其中AATT为优势基因型组合,频率为0.425。单标记关联分析表明：rs01位点的AA、AG基因型的个体和GG基因型个体在4月龄体重、胸围上差异显著（P＜0.05）,在6月龄体高、胸围上差异显著(P＜0.05)。rs02位点CC基因型个体在4月龄体重、体高、胸围和6月龄胸宽上显著优于TT、TC基因型个体（P＜0.05),在4月龄体斜长、6月龄体高和体斜长上极显著优于TT、TC基因型的个体（P＜0.01）。rs30位点上,GG基因型的个体在4月龄体重、胸围与其他两种基因型个差异显著(P＜0.05),3个基因型的个体在6月龄胸围上均有显著差异（P＜0.05）。rs34位点的3个基因型的个体仅在4月龄体重上差异显著(P＜0.05)。rs01-rs02组合基因型关联分析发现：GGCC基因型组合的个体在4月龄体重、体高、体斜长、胸围上与其他基因型之间差异显著（P＜0.05）,GGCC基因型组合的个体在6月龄体高、体斜长、胸宽上与其他基因型组合的个体差异显著（P＜0.05）。【结论】RIPK2基因对绵羊生长性状具有较显著的影响,其SNPs作为分子标记对乌珠穆沁绵羊生长性状的选育具有一定的指导意义。     

不同番茄品种对番茄黄化曲叶病毒的抗病性分析

【目的】番茄黄化曲叶病毒病 (Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV) 是一种影响全世界番茄生产的病害,培育抗病品种是最有效、经济和持久的防控手段。目前生产上应用的抗病品种繁多,但存在对TYLVC不同抗性基因的抗性水平研究甚少、了解不够全面的问题。为了解带有不同抗性基因的番茄品种对番茄黄化曲叶病毒病的抗性,对北京市农林科学院蔬菜中心培育的番茄品种抗病性进行检测,并利用半定量RT-PCR方法分析抗病基因和抗病蛋白的表达水平。【方法】选取携带有Ty3a/Ty3a的番茄材料秋光285（Ty3a 纯合）、棚137×246（Ty3a 杂合）,携带Ty1+Ty3a纯合的秋光120、携带Ty1+Ty3a杂合的秋光81和感病对照M82为试验材料,观察番茄植株自然条件下发病情况。通过调查发病率和病情指数,考查这些番茄品种的抗病性,并利用RT-PCR方法分析抗病基因Ty1和Ty3a以及病程相关蛋白葡聚糖酶和几丁质酶基因的表达水平。【结果】携带抗性基因的杂合体、纯合体抗病性差异不明显,含有两个抗性基因和含有单一抗病基因品种的抗病性稍有差异,但差异不显著。半定量RT-PCR结果显示不同番茄品种在感染TYLCV后,体内抗性基因表达量随着发病时间的增加,Ty-3a和Ty-1的表达量逐渐增强。Ty-3a在4个番茄品种中表达水平由弱到强依次为秋光285（Ty-3a纯合）、棚137×246（Ty-3a杂合）、秋光120（Ty-1+Ty-3a纯合）和秋光81（Ty-1+Ty-3a杂合）,Ty-1在秋光81中的表达显著高于在秋光120中的表达。同时,植株体内葡聚糖酶和几丁质酶基因表达量均比对照显著增加,并随着发病时间的增加逐渐增强。在发病20 d和30 d后,携带Ty-1+Ty-3a杂合的秋光81的葡聚糖酶基因表达显著强于其他几个品种。【结论】几个番茄材料对TYLCV的抗性由弱到强依次为秋光285（Ty3a 纯合）、棚137×246（Ty3a杂合）、秋光120（Ty1+Ty3a纯合）和秋光81（Ty1+Ty3a杂合）。不同番茄抗病品种感染TYLCV后,体内抗性基因表达量随发病时间增加而增强,葡聚糖酶和几丁质酶基因表达量均比感病对照显著增加,表明番茄抗病品种在感染TYLCV后的抗病性除了与抗性基因的表达有关外,同时也与抗病相关蛋白表达增强有关。     

蛋清内注射三碘甲腺原氨酸对鸭出雏前后生长发育、血清中甲状腺激素水平及肝脏中D1和D3表达的影响

【目的】以金定鸭为研究对象,孵化前向蛋清内注射三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine,T3）,检测鸭出雏前后体重、胸浅肌重、血清中甲状腺激素（thyroid hormones,THs）水平的变化,分析肝脏中I型脱碘酶（deiodinases I,D1）和Ⅲ型脱碘酶（deiodinasesⅢ,D3）mRNA表达、蛋白水平及酶活性的变化,探究外源性T3对鸭出雏前后生长发育及肝脏中脱碘酶表达的影响。【方法】将200枚金定鸭种蛋随机分为对照组和试验组,在孵化前从蛋的锐端往试验组种蛋蛋清内注射100 μL含250 ng T3的生理盐水,对照组注射不含T3的100 μL生理盐水,两组种蛋在相同条件下同期孵化。在27胚龄和7日龄时,记录鸭的体重和胸浅肌重,采用放射免疫分析法检测鸭血清中T3和四碘甲腺原氨酸（thyroxine,T4）水平,利用实时荧光定量PCR检测鸭肝脏中D1和D3的mRNA表达,利用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测鸭肝脏中D1和D3蛋白水平及酶活性。【结果】在27胚龄和7日龄时试验组鸭的体重（P = 0.035,0.044）和胸浅肌重（P = 0.027,0.037）均显著高于对照组;试验组血清中T3和T4水平在27胚龄时与对照组之间差异不显著（P > 0.05）,而7日龄时均显著低于对照组（P = 0.040,0.040）;试验组鸭肝脏中脱碘酶mRNA表达量仅D3在7日龄时显著低于对照组（P = 0.040）;在7日龄时试验组鸭肝脏中D1和D3的蛋白含量和酶活性亦均显著低于对照组（P = 0.017,0.045;P = 0.013,0.039）。鸭出雏前后的胸浅肌重与血清中T3水平呈强的负线性相关（r = -0.431,P = 0.025）;血清中T3水平与肝脏中D3的mRNA表达呈极显著正向相关（r = 0.778,P = 0.005）,血清中T4水平与D1和D3的蛋白水平和酶活性均呈正线性相关（r = 0.685,P = 0.020;r = 0.662,P = 0.026;r = 0.710,P = 0.014;r = 0.705,P = 0.015）。【结论】蛋清内注射T3促进了鸭出雏前后生长发育,同时伴随着出雏后循环中THs水平的降低,肝脏中D1和D3的表达发生下调。     

水稻短穗小粒突变体sps1的鉴定与基因精细定位

【目的】通过对一个水稻短穗小粒突变体的鉴定与基因精细定位,为水稻等禾本科作物的籽粒发育及分子改良奠定基础。【方法】在水稻EMS诱变体库中鉴定到一个短穗小粒突变体,暂命名为sps1（shorten panicle and seed 1）。成熟期观察野生型和sps1的形态变化,考察株高、节间长、穗实粒数、结实率和千粒重等农艺性状;对野生型和sps1籽粒外稃内外表皮中部进行扫描电镜观察,并利用石蜡切片进一步分析野生型和sps1籽粒的形态变化;配制缙恢10号/sps1杂交组合进行遗传分析,并利用其F₂群体进行基因精细定位;对野生型和sps1两叶一心期的叶鞘进行油菜素内酯（brassinolide,BR）敏感性试验;抽穗期分析SPS1在水稻根、茎、叶、鞘和穗中的表达,并对籽粒发育相关基因和BR相关基因进行qPCR分析。【结果】sps1穗和倒1、2、3的节间长度均极显著短于野生型,导致株高半矮化;此外,sps1穗枝梗数、结实率和千粒重也显著降低;扫描电镜观察发现sps1外稃中部内外表皮细胞长度极显著小于野生型,宽度则极显著变大,石蜡切片观察进一步证实了sps1籽粒宽短是由细胞变短、变宽造成的;籽粒发育相关基因qPCR分析发现,部分通过调控细胞分裂和扩展进而影响水稻籽粒发育的基因表达量发生了显著变化,在sps1中,AFD1、SLG、HGW和GS3的表达量显著上调,GW7和GID1显著下调;选取符合3﹕1分离比例的F₂代分离群体中的突变单株进行基因定位,最终将调控基因精细定位在第7染色体上标记sps1-3和sps1-2之间134 kb的物理范围内,包含19个注释基因;经测序,与野生型相比,发现sps1中的Os07g0616000在编码区有一个A-T的碱基替换,致使编码的赖氨酸变成了终止密码子,导致蛋白翻译提前终止,初步确定为候选基因。qPCR分析发现SPS1在水稻的根、茎、叶、鞘和穗中均有表达,且在茎秆中的表达量最高;生物信息学分析发现,SPS1是DEP2的一个新等位基因。sps1对外源BR的敏感性降低,BR钝感基因D1的表达极显著下调;推测SPS1/DEP2可能通过BR信号传导途径调控水稻籽粒和株型的发育。【结论】sps1是一个水稻短穗小粒突变体,SPS1编码一个表达蛋白,是DEP2的新等位基因,通过BR信号传导途径调控水稻籽粒和株型的发育。     

奶牛乳房炎乳腺膜蛋白的比较蛋白质组学研究

【目的】通过分析临床健康和乳房炎奶牛乳腺组织膜蛋白的差异表达,以期在蛋白质水平探索奶牛乳房炎的发生机理。【方法】采用二维凝胶电泳技术分离了临床健康和乳房炎奶牛的乳腺组织膜蛋白,经考马斯亮蓝染色后PDQuest 7.4软件匹配、检测凝胶中差异表达的蛋白点,对12个差异蛋白点采用高效液相色谱串联离子阱质谱分析,SEQUEST软件搜索NCBInr数据库。半定量RT-PCR分析差异表达蛋白的mRNA水平。【结果】12个差异蛋白点鉴定为11种蛋白质,其中9个蛋白点在临床型乳房炎奶牛乳腺组织膜蛋白中表达量上调而3个蛋白点表达量下调,主要涉及细胞膜骨架系统、信号转导、物质结合和传递等生物学功能。半定量RT-PCR分析表明,乳房炎奶牛乳腺组织中钙粒蛋白B的mRNA表达水平是健康奶牛的1.6倍。【结论】推测这些差异蛋白的表达变化与奶牛乳房炎发生相关,为从蛋白质水平揭示奶牛乳房炎的发生机理以及发现潜在的治疗目标蛋白提供了理论依据。     

临床型奶牛乳房炎乳腺组织的比较蛋白质组研究

 【目的】采用比较蛋白质组学技术分析、检测了临床健康与乳房炎奶牛乳腺组织中的差异表达蛋白,以寻找药物治疗目标,探讨奶牛乳房炎的发生机理。【方法】采用二维凝胶电泳分离临床健康与乳房炎奶牛的乳腺组织蛋白,考马斯亮蓝染色,PDQuest7.4软件自动匹配检测差异表达蛋白斑点,高效液相色谱串联离子阱质谱分析鉴定。【结果】凝胶图谱中检测出15个差异蛋白斑点,串联质谱分析后有12个蛋白斑点可搜索到相应的结果,对应于10种蛋白质,主要涉及结合、运输和催化活性等分子功能,参与细胞、代谢及生物调节等生理过程。【结论】临床健康与乳房炎奶牛的乳腺组织中蛋白的表达模式存在差异,表达差异蛋白与奶牛乳房炎的发生相关,对其分析有利于探索机体的生理病理状态,还可为揭示奶牛乳房炎的发生机理提供直接依据。     

热应激状态下泌乳奶牛通过激活GHIGF-I轴增强糖异生变化

【目的】选取分娩1周后的泌乳期荷斯坦奶牛6头,提前适应期1周后,正式饲喂从2013年6月29日至8月5日,总共35 d(5周),使泌乳奶牛处于热应激状态。进而检测泌乳奶牛乳产量及乳蛋白含量,血液中生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF-I)、葡萄糖以及肝脏中热休克蛋白70(HSP70)和糖异生作用的变化情况,拟从GH-IGF-I轴的角度阐明泌乳奶牛发生热应激时对糖异生作用及乳品质下降的机制。为进一步揭示奶牛热应激的发生机理及控制奶牛热应激的发生提供理论依据。【方法】分别统计第1—5周泌乳奶牛的产奶量及分析乳蛋白含量,并采集泌乳奶牛颈静脉血液和进行活体采取肝脏组织的方法,检测血液中葡萄糖和GH、IGF-I的含量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对奶牛肝脏组织中HSP70和糖异生的关键酶丙酮酸羧化酶(PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)进行检测。【结果】在35 d的饲喂过程中,日间平均气温在32℃以上的持续时间达25 d,且最高温度为38℃,高温持续时间大于72 h,即此气候条件下奶牛处于一个热应激状态。随着泌乳奶牛热应激程度的不断加深,从第1周到第5周产奶量和乳蛋白含量都有不同程度的下降。通过比较第5周和第1周泌乳奶牛肝脏中HSP70的表达,发现第5周HSP70的表达量极显著高于第1周。检测血液中GH、IGF-I以及葡萄糖的含量,发现在第5周的时候其含量均高于第1周且差异显著(P0.05);检测泌乳奶牛肝脏组织中PC和PEPCK的表达水平,发现第5周显著高于第1周(P0.05);通过检测第5周与第1周肝脏组织中GH和IGF-I受体的表达水平,发现GHR和IGFR同样上调,其中IGFR显著上调(P0.05)。【结论】随着泌乳奶牛热应激的程度的不断加深,血液中的葡萄糖含量显著升高,其可能是由于垂体分泌的GH刺激肝脏产生更多的IGF-I,即通过GHIGF-I轴上调肝脏糖异生途径关键酶的表达,使糖异生途径处于激活状态。而乳中乳蛋白含量的下降可能是由于其前体物被过多的用来进行糖异生作用,增加血液中葡萄糖含量,维持机体正常供能所致。     

运输前后奶牛血清蛋白质组的变化

【目的】从血清蛋白组研究运输对奶牛机体的影响,充分理解运输对奶牛的生理病理影响及其潜在的作用机制提供理论依据。【方法】采用二维凝胶电泳（2-DE）结合MADIL-TOF-TOF串联质谱的方法对运输前第7天、运输后3 h和第7天奶牛的血清进行蛋白质组分析鉴定。【结果】运输可引起奶牛血清中14个蛋白点的表达丰度发生变化,有12个蛋白点得到有效鉴定。与运输前第7天相比,血清白蛋白、IgG1 重链恒定区、类型II细胞骨架I和转甲状腺素蛋白在运输后3 h表达量降低,而α1-酸性糖蛋白、结合珠蛋白、nesprin-2、微管微丝交联因子1、酪氨酸蛋白激酶Fps85D、输出蛋白5和一个未知蛋白点在运输后3 h的表达量升高;在运输后第7天,除α1 酸性糖蛋白外,上述蛋白的表达量与运输前第7天无显著差异。【结论】运输引起变化的蛋白主要涉及机体急性期应答和免疫反应、物质运输以及细胞内多个代谢途径,表明运输引起了奶牛应激。     

全棉籽替换TMR中部分精料对泌乳后期奶牛生产性能的影响

[目的]探讨全棉籽替换TMR(全价混合日粮)中精料对奶牛生产性能的影响.[方法]试验选用产奶量、膘情、胎次相近、泌乳后期健康的荷斯坦奶牛30头,褐牛25头.采用自身对照,对照期按牛场常规TMR饲喂奶牛,试验期在TMR中用2kg全棉籽替换等量的精料饲喂奶牛,与对照期相比较.[结果]试验期乳脂率、乳糖率极显著地高于对照期(P＜0.01),荷斯坦奶牛和褐牛的乳脂率提高了9.09;和8.70;;荷斯坦奶牛和褐牛的乳糖率提高了2.82;和7.98;;试验期奶牛产奶量、干物质采食量、乳蛋白都有增高的趋势,但与试验期相比差异不显著(P＞0.05).[结论]在奶牛泌乳后期,用2kg全棉籽替换TMR中等量(2kg)精料可以提高奶牛的乳脂率和乳糖率,但对体细胞数及其它乳成分的影响差异不显著(P＞0.05).     

不同油料籽实对奶牛瘤胃液、血浆脂肪酸组成及乳脂CLA含量的影响

 【目的】研究不同脂肪酸构成的油料籽实对奶牛瘤胃液和血浆中脂肪酸的组成及乳脂CLA含量的影响,初步探讨乳脂CLA合成机制,为改善牛奶脂肪酸构成,提高乳脂中CLA含量寻找合适途径。【方法】以3头装有永久性瘤胃瘘管的经产荷斯坦奶牛为试验动物,采用3×3拉丁方设计,在日粮中添加不同油料籽实（葵花籽、亚麻籽、菜籽）,3种日粮的粗脂肪含量基本相同,测定采食后不同时间点瘤胃液、血浆及乳脂中脂肪酸含量。【结果】葵花籽组奶牛乳脂中CLA、t11-C18﹕1、PUFA及LCFA比例均显著高于菜籽组和亚麻籽组（P＜0.05）;葵花籽组奶牛血浆中t11-C18﹕1的比例显著高于菜籽组和亚麻籽组（P＜0.05）;瘤胃液中各种脂肪酸含量在3组之间差异不显著（P＞0.05）,随采食后时间的延长,饱和脂肪酸含量逐渐增加,不饱和脂肪酸含量逐渐减少,不同时间点瘤胃液中CLA的比例均较低;瘤胃液、血浆中的t11-C18﹕1含量对乳脂中CLA含量的决定系数（R2）分别为0.841和0.766。【结论】富含亚油酸的葵花籽在优化奶牛乳脂肪酸构成、提高CLA含量方面效果最好。     

两种微生态制剂对澳洲荷斯坦奶牛生产性能的影响

[目的]研究微生态制剂对奶牛生产性能的影响.[方法]在新疆中州牛场选择450头年龄、胎次相同,泌乳量接近的澳洲荷斯坦奶牛,随机分成三组.第-组为对照组(CT组),第二组(XP组)每天饲喂50 g"益康XP",第三组(PM组)每天饲喂24g"PM发酵粉";试验期3个月,每10d测日产奶量,每月数据汇总处理,每月底采集乳样,检测其乳脂率、乳蛋白、乳糖、乳中4脂固形物、乳密度、冰点、体细胞数、pH值、灰分和电导率.[结果]与CT组相比,XP组与PM组均显著提高奶牛产奶量和乳脂率(P<0.05);与CT组相比,XP组和PM组均能有效降低乳中体细胞数(P>0.05),且以PM组效果更佳.此外,与CT组相比,XP组和PM组对乳糖、乳中非脂固形物、乳密度、冰点、灰分、电导率和pH值影响并不显著(P>0.05),[结论]在大规模奶牛试验中,XP组和PM组均提高了奶牛产奶量和乳品质,且PM组添加剂减少奶牛乳中体细胞数效果更加明显.     

硫辛酸对围产期奶牛血清脂肪代谢和肝功能酶的影响

目的探讨硫辛酸对围产期奶牛血清脂肪代谢和肝功能酶的影响。方法选择产前约20d的干乳期奶牛48头,分为4组,Ⅰ组为对照组,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别每头补饲硫辛酸3、5、8g·d-1,连续50d,检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(Chol)、非酯化脂肪酸(NEFA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量及血清碱性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性。结果第Ⅲ、Ⅳ组血清NEFA含量第20天后低于对照组,第Ⅳ组第30天显著低于对照组(P0.05);试验组血清AST活性第30天后均显著(P0.05)或极显著(P0.01)低于对照组;其它指标各处理组之间无显著差异(P0.05)。结论硫辛酸可改善围产期奶牛的脂肪代谢,有效保护奶牛围产期肝脏功能的损伤。     

SCD1基因不同基因型的差异表达及与牛奶中脂肪酸组成的相关性

【目的】探索中国南方荷斯坦奶牛SCD1基因不同基因型的差异表达及与牛奶中脂肪酸组成的相关性。【方法】以同一奶牛养殖场的303头中国荷斯坦奶牛为样本,利用PCR-SSCP技术检测SCD1基因第5外显子878 bp位置的多态性,采用定量FQ-PCR技术初步检测3种基因型的相对表达量,并运用气相色谱技术分析牛奶中脂肪酸的组成。【结果】共检测到3种基因型,即CC、CT和TT,基因型频率分别为0.617、0.339和0.044,等位基因C和T的频率分别为0.787和0.213,仅发现CT表达量显著高于TT（P＜0.05）。CC、CT和TT在脂肪酸C4﹕0、C12﹕0、C17﹕0上存在显著差异（P＜0.05）;在脂肪酸C6﹕0、C8﹕0、C14﹕0、C15﹕0和c9t11CLA上,3种基因型间差异极显著（P＜0.01）。在总饱和脂肪酸含量上TT显著高于CC和CT（P＜0.05）。【结论】SCD1基因C878T位点的突变对中国荷斯坦牛SCD1基因不同基因型的表达和乳脂肪酸成分有较大的遗传效应。     

基于GC-MS技术的蹄叶炎奶牛血浆代谢谱分析

【目的】利用气相色谱/质谱联用技术(gas chromatograph tandem mass spectrometer technology,GC-MS)对奶牛血浆进行代谢组学分析,以明确奶牛发生蹄叶炎时血浆中代谢物的变化,进一步揭示其发病机制。【方法】根据蹄叶炎奶牛的临床症状和活动量情况,选取蹄叶炎患病组S和健康对照组C奶牛各10头,采集血浆样品,经衍生化处理后,利用GC-MS方法对两组奶牛的血浆进行全部代谢物检测。用SIMCA-P 11.5软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法分析(supervised partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA),对蹄叶炎组奶牛和健康组奶牛检测数据进行模式识别分析,筛选差异代谢物,并利用生物信息学方法进行代谢通路富集分析。为进一步验证代谢组学的试验结果,检测了与差异代谢通路相关的脂质代谢指标和抗氧化能力指标。【结果】利用GC-MS方法,在奶牛血浆中共检测到242种代谢物,通过多元统计分析结合t-检验筛选出37种差异代谢物(VIP1,P0.05),其中在蹄叶炎奶牛血浆中3种物质含量上调(FC1),分别是氨基氧乙酸、油酸、乳糖,34种物质含量下调(FC1),包括脂肪酸、氨基酸等。经代谢通路富集分析,发现变化显著(P0.05)的代谢通路包括脂肪酸生物合成通路,甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路,不饱和脂肪酸生物合成通路,嘌呤代谢通路,甲烷代谢通路,苯丙氨酸代谢通路和氰基氨基酸代谢通路。在验证试验中,发现两组奶牛血浆中脂质代谢相关指标差异显著,且蹄叶炎患病牛血浆抗氧化能力显著低于健康牛,与代谢组学结果一致。【结论】利用GC-MS技术分析了蹄叶炎患病牛与健康奶牛血浆代谢谱的变化,发现两组间代谢物存在显著差异,并筛选出了37种差异代谢物,而这些差异分子可能成为奶牛蹄叶炎早期诊断或群体监测的潜在生物标记物。本结果全面揭示了奶牛蹄叶炎发生后血浆代谢物的代谢规律,为进一步阐明其发病机制提供理论依据。