番荔枝花器官发育基因AsAG的克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】从番荔枝中分离花器官特征决定基因AGAMOUS，并进行亚细胞定位及基因表达分析，为进一步研究该基因参与调控花发育调控的分子机理，及解决番荔枝花发育异常问题奠定基础。【方法】以番荔枝成熟花为材料，通过试剂盒提取总RNA，并以RACE方法克隆获得基因AG的全长序列。序列拼接和氨基酸序列分析采用DNAMAN软件；相似性分析通过BLASTn和BLASTp程序进行；进化树构建采用MEGA 5.1软件；蛋白质二级结构预测与3D结构建模分别采用ExPaSy的SOPMA和Phyre2程序进行；亚细胞定位表达采用烟草上皮细胞瞬时转染系统和基因枪轰击洋葱表皮细胞方法；AG在花发育不同时期、不同器官及不同激素信号分子处理下的表达特性分析，利用实时荧光定量RT-PCR方法。【结果】从番荔枝中克隆得到AGAMOUS，其cDNA全长ORF序列长度为669 bp，编码222个氨基酸，命名为AsAG，序列提交到GenBank（登录号为KT159768）。二级结构预测发现AsAG所编码蛋白由延伸链结构（俄extended strand）、α-螺旋（alpha helix）、β-转角（beta turn）和不规则卷曲（random coil）组成，四者比例分别为14.41%、59.46%、8.11%和18.02%。生物信息学分析显示AsAG编码的蛋白与海枣（XP 008781978.1）、芦笋（BAD83772.1）、拟南芥（AT4G18960）、油棕（XP 010912706.1）、山玉兰（AFH74390.1）、石斛（ABQ08574.1）、红花玉兰（AEO52692.1）等同源蛋白的相似度达79%-84%。ASAG蛋白含有一个高度保守的MADS-box结构域和一个次级保守的K区，该蛋白分子量为25.7 kDa，等电点为9.15，为稳定蛋白，无信号肽。亚细胞定位显示AsAG编码蛋白定位于细胞核。实时定量RT-PCR结果表明，AsAG在不同的器官中表达量存在差异，在花中表达量最高。AsAG在番荔枝花发育的整个过程中都有表达，而在花蕾期Ⅳ中表达量最高。进一步分析发现AsAG的表达水平呈现花器官特异性分布（雄蕊＞雌蕊＞萼片＞花瓣）。进一步研究表明，AsAG在畸形花中的表达量低于正常花。检测GA和ABA等不同信号分子分别处理番荔枝花芽2 h和4 h后AsAG的表达量，结果表明AsAG的表达受GA负调控，受ABA正调控。【结论】推测番荔枝AsAG可能参与雌蕊和雄蕊的发育及激素信号的响应。

Cloning,Subcellular Localization and Expression Analysis of AsAG from Sugar Apple (Annona squamosa L.)