表达犬瘟热病毒融合蛋白基因重组腺病毒的构建与鉴定

利用pVAX1载体的表达元件CMV启动子和poly(A)多聚腺苷酸信号构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因(F)的重组犬腺病毒。首先,利用酶切、连接等实验方法构建了含CDV启动子F蛋白基因表达盒的转移质粒pVAXΔE3LPF。再以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建重组质粒pCAV-2-pVAXLPF,利用脂质体介导方法转染MDCK细胞,转染3次后,细胞出现了典型的犬腺病毒感染样病变。电镜负染和切片观察、酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明,成功构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因的重组犬腺病毒,表达的融合蛋白分子质量为72ku。在MDCK细胞上连续传30代试验表明重组病毒CAV-2-pVAXLPF具有良好的遗传稳定性。     

表达外源绿荧光蛋白的重组犬2型腺病毒的构建及其生物学特性分析

以pUC18载体为骨架质粒,犬2型腺病毒(canine adenovirus 2,CAV-2)Tomnto A26/61株为亲本毒株,以复制非必需区E3的侧翼序列为同源重组臂,对外源基因的插入靶点E3区进行了缺失,并在缺失位置插入hCMV IE启动子、多克隆位点,增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)、SV40早期转录poly-A信号,构建了E3区缺失的转移栽体pUC-△E3-EGFP.该载体与CAV-2亲本毒株共转染MDCK细胞,二者发生同源重组,经蚀斑筛选获得了表达EGFP的重组病毒rCAV-2△E3-EGFP.经鉴定重组病毒保持了亲本毒株的生物学性状并能够稳定表达外源基因,动物试验证实E3区的缺失对病毒的致病力无明显影响,为进一步开展CAV-2活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台.     

表达犬瘟热病毒核蛋白的重组犬2型腺病毒构建与包装

为构建表达犬瘟热病毒核蛋白的重组犬2型腺病毒,用MluⅠ和SphⅠ双酶切真核表达载体pVAXLPN,获得CDVN基因表达盒,将CDVN基因表达盒克隆入预先用SspⅠ酶切后的线性化质粒pVAXAE3中,构建含CDVN基因表达盒的转移质粒pVAX△E3LPN。用NruⅠ和SalⅠ双酶切转移质粒pVAX△E2LPN。回收E3区部分缺失的含CDVN基因表达盒的目的片段,定向克隆入同样酶切处理含CAV-2全基因组的质粒载体ppoly2-CAV-2中,构建E3区部分缺失的包含CDV N基因表达盒的重组质粒pCAV-2-CDVLPN。重组质粒pCAV-2-CDVLPN经AscⅠ酶切获得线性化基因组CAV-2-CDVLPN。此基因组与NruⅠ和Sal Ⅰ分别酶切CAV-2 SY基因组获得的片段混合,利用脂质体介导共转染MDCK细胞,重复转染3次后。出现典型CAV-2病变,经电镜观察和酶切鉴定,证明表达犬瘟热核蛋白的重组犬2型腺病毒包装成功。     

基于CRISPR/Cas9系统的MDCK细胞IFN-β1编码序列的敲除

为了建立高品质的犬肾(MDCK)单克隆细胞系,使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除,构建细胞培养禽流感病毒(AIV)增殖体系。首先,根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后,用3种载体共转染MDCK细胞,通过GFP阳性特征分选单细胞克隆,单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序,确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系,与原始细胞相比,该细胞系的病毒增殖能力提高。     

比格犬MC4R基因与肥胖的关系研究

[目的]探讨犬黑素皮质素受体-4(MC4R)基因与肥胖的关系。[方法]通过PCR-RFLP技术分析犬MC4R基因多态性与体重的关系。通过载体构建和细胞培养技术来构建犬MC4R基因的真核表达载体并转染MDCK细胞,研究该基因的体外表达情况。最后通过小鼠尾静脉高压注射重组真核表达载体的方法进行动物试验。[结果]比格犬226 bp C/A多态性与体重呈显著相关。犬MC4R基因在MDCK细胞内成功表达。MC4R重组体裸质粒注射后小鼠的体重有明显变化。[结论]MC4R基因能够促进小鼠的体重增加。该基因与肥胖的发生密切相关,将为肥胖机制的研究提供理论依据。     

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达

[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。     

犬SLAM基因真核表达载体的构建及在MDCK细胞中的稳定表达

为了构建稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的MDCK细胞系,该研究从犬外周血淋巴细胞中克隆了犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)细胞受体SLAM基因,将鉴定正确的SLAM基因插入到高效真核表达载体pcDNA3.1(+)中.采用脂质体转染的方式将重组质粒pcDNA3.1/SLAM转染到MDCK细胞中,采用G418加压筛选及有限稀释法克隆,获取稳定表达SLAM的MDCK细胞株.结果表明,成功构建了SLAM的真核表达载体pcDNA3.1/SLAM,并通过G418筛选获得了稳定表达SLAM的细胞系MDCK.     

抗犬瘟热病毒荧光标记单抗的制备和初步鉴定

1材料与方法 1．1材料 1．1．1病毒与细胞。犬瘟热病毒（CDV）、狂犬病毒（RV）、犬细小病毒（CPV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬腺病毒（CAV）,非洲绿猴肾细胞（Vero）、犬肾细胞（MDCK）、猫肾细胞（F81）,犬瘟热病毒单克隆抗体CE3由军事医学科学院军事兽医研究所犬病研究中心提供。     

OMⅢ株口蹄疫病毒P1-2A-3C腺病毒载体的构建

选取O型口蹄疫病毒（FMDV）OMⅢ株的P1-2A和3C作为目的基因,分别扩增出目的片断后,定向亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,得到重组载体pAdTrack-P12A3C,重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后得到重组腺病毒质粒（pAd-P12A3C）。将重组腺病毒质粒线性化后转染至HEK293细胞中可观察到典型的绿色荧光,从重组腺病毒的基因组中可扩增到P12A3C基因,证实获得了含有P12A3C的重组腺病毒。     

KLF15基因表达特征及其腺病毒超表达载体的构建

【目的】分析锌指蛋白转录因子15(KLF15)在小鼠各组织及C2C12细胞分化过程中的表达情况,构建KLF15的腺病毒超表达载体。【方法】采集小鼠肝、脾、肾、脂肪、骨骼肌及培养的C2C12成肌细胞,提取不同分化时期(0,2,4d)的C2C12细胞及不同组织的RNA,检测KLF15的表达情况;过夜连接HindⅢ和XbaⅠ双酶切后的pAdTrack-CMV与KLF15真核表达质粒(pcDNA3.1-KLF15),获得pAdTrack-KLF15质粒。将该质粒经PmeⅠ线性化后转入BJ5183感受态细胞进行重组,构建pAdEasy-KLF15腺病毒超表达载体。将pAdEasy-KLF15质粒PacⅠ酶切线性化回收后,转染293A细胞进行包装、扩繁和纯化。将获得的KLF15重组腺病毒侵染C2C12细胞,实时荧光定量PCR检测其对KLF15表达的影响。【结果】KLF15在C2C12成肌细胞分化过程中表达显著升高,并在分化后期达最高值;KLF15在肝脏、肾脏和脂肪中的表达水平极显著高于骨骼肌和脾脏。成功获得了pAdEasy-KLF15腺病毒超表达载体,其侵染C2C12细胞后能显著上调KLF15mRNA的表达水平。【结论】KLF15基因在C2C12成肌细胞中高表达,并成功构建了KLF15重组腺病毒载体。     

PRRSV GP5与GP4蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

[目的]实现PRRSV GP5与GP4蛋白在同一载体中表达各自编码的蛋白,发挥GP5蛋白在体液免疫中的优势和GP4蛋白在信号转导中的作用。[方法]利用RT-PCR扩增出GP5与GP4基因,克隆到pIRESneo载体的多克隆酶切位点及新霉素磷酸转移酶位点中,用XhoⅠ和NruⅠ双酶切含GP5和GP4基因的表达盒,将此表达盒克隆到犬2型腺病毒E3区缺失性载体pPolyⅡ-CAV-2-△E3中,以AsⅠc和PmeⅠ双酶切进行鉴定。[结果]将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,可以诱导产生较强的体液免疫应答（ELISA抗体和中和抗体）。[结论]该重组腺病毒具有较好的免疫原性,可为研制有效的亚单位疫苗奠定基础。     

丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒（HCV）H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中，构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2，用重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒磷酸钙共沉淀法转染293T细胞,包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞，经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞仪技术（FACS）分析，结果表明,HCV E1E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E1E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠，经FACS分析免疫鼠血清，成功诱导小鼠产生了抗HCV E1E2蛋白的抗体，Western blot检测结果表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合。     

OM Ⅲ株口蹄疫病毒P1-2A-3C腺病毒载体的构建

选取O型口蹄疫病毒(FMDV)OMⅢ株的P1-2A和3C作为目的基因,分别扩增出目的片断后,定向亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,得到重组载体pAdTrack-P12A3C,重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后得到重组腺病毒质粒(pAd-P12A3C).将重组腺病毒质粒线性化后转染至HEK293细胞中可观察到典型的绿色荧光,从重组腺病毒的基因组中可扩增到P12A3C基因,证实获得了含有P12A3C的重组腺病毒.     

番木瓜eIF4E和eIFiso4E酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

通过RT-PCR获得番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的编码区,将其分别克隆到pBD-GAL4载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-eIF4E,pBD-GAL4-eIFiso4E。测序正确后,将重组质粒导入YRG-2酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明,获得了正确的番木瓜eIF4E,eIFiso4E基因编码区,并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中,且转化有诱饵载体的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,在SD/-His-Trp营养缺陷平板上不能生长,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,这为下一步利用酵母双杂交系统检测番木瓜eIF4E,eIFiso4E蛋白与病毒的相互作用奠定了基础。     

重组腺病毒介导的猪瘟 E0基因在山羊乳腺中的表达

为使猪温病毒(CSFV)E0蛋白在奶山羊乳腺中得以合成和分泌,一段上游带有信号肽和His标签序列的CSFVE0基因通过腺病毒穿梭载体被插入到腺病毒质粒中,将此重组质粒转染293A细胞包装得到重组腺病毒Ad-hisE0。为证明其有效性,用Ad-hisE0感染293A细胞,实时定量PCR检测显示E0基因的表达显著提高。用Ad-hisE0分别感染牛乳腺上皮细胞和泌乳期山羊乳腺,SDS-PAGE和Western blot分析结果显示出E0蛋白分别位于26ku和48ku处的2条特异性条带。证实构建的腺病毒Ad-hisE0可以介导重组融合蛋白CSFV E0在山羊乳腺中的表达和分泌。     

小鼠CHD5基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠染色质区解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒载体并在NIH3T3细胞中验证其干扰作用.方法:人工合成靶向CHD5的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法插入到穿梭载体pSES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-CHD5siRNA重组质粒,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒Adr-simCHD5,然后感染NIH3T3细胞,用RT-PCR和Western Blot方法检测其对CHD5mRNA和蛋白表达的干扰效果.结果:得到高滴度Adr-CHD5siRNA重组腺病毒,RT-PCR和Western Blot结果表明该重组腺病毒能有效地降低CHD5基因的表达.结论:成功构建Adr-CHD5siRNA重组腺病毒载体,并在NIH3T3细胞上实现CHD5基因表达抑制,为进一步研究CHD5基因功能奠定了基础.     

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。     

乌鲁木齐市3E系统协调发展评价研究

以乌鲁木齐市为例,对其2003-2007年的3E协调度进行评价研究。首先构建适合研究区的评价指标体系,运用APH法确定各级指标的权重;然后利用模型分别计算研究区各子系统的发展水平和协调度,进而计算出3E系统的整体发展水平和协调度。结果表明,乌鲁木齐市能源、经济系统的发展速度较快,环境系统处于滞后状态,3E系统协调度处于不协调的状态。最后提出了促进乌市3E协调发展的对策建议。     

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

犬MC4R突变体D90N真核表达载体的构建及表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4（MC4R）突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。