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为了建立高品质的犬肾(MDCK)单克隆细胞系,使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除,构建细胞培养禽流感病毒(AIV)增殖体系。首先,根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后,用3种载体共转染MDCK细胞,通过GFP阳性特征分选单细胞克隆,单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序,确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系,与原始细胞相比,该细胞系的病毒增殖能力提高。 相似文献
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为考察BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）工艺参数及病毒增殖过程中代谢动力学，将PRV接种于BHK-21悬浮细胞，考察接毒时细胞密度、病毒感染复数（MOI）及收毒时间对病毒效价的影响，测定培养过程中葡萄糖（Gluc）、乳酸（Lac）和谷氨酰胺（Gln）浓度，计算病毒增殖过程中各参数代谢速率。结果显示，将MOI为0.01的PRV病毒接种BHK-21悬浮细胞，其病毒滴度在42 h达最高8.5 lgTCID50/mL。代谢参数检测结果表明，BHK-21细胞在接毒36 h后细胞开始出现死亡。PRV在BHK-21悬浮细胞中的增殖特性为伪狂犬病毒的规模化培养及疫苗开发提供了技术基础。 相似文献
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旨在构建高质量的禽源细胞系，应用CRISPR/Cas9技术实现鸡胚成纤维细胞(DF-1)的Toll样受体7(TLR7)编码基因的敲除，构建稳定的细胞培养禽腺病毒4型(FAdV-4)增殖体系。采用荧光定量PCR的方法对FAdV-4感染DF-1细胞后先天性免疫信号通路中效应分子进行检测，选择转录水平显著上调的基因TLR7作为研究对象；构建sgRNA载体与Cas9表达载体共转染DF-1细胞，经绿色荧光蛋白(GFP)阳性特征分选单克隆，PCR验证及增毒试验筛选后获得TLR7编码序列敲除的DF-1-TLR7-KO#3单克隆细胞系，命名为DF-1-TLR7-KO细胞。对敲除前后DF-1细胞的天然免疫系统对FAdV-4感染的拮抗效应和病毒在不同细胞中增殖效率的差异进行了研究。结果表明：成功构建的TLR7编码序列敲除的DF-1细胞系，与原始细胞相比病毒增殖能力提高。试验对细胞的天然免疫系统与FAdV-4感染的互作机理进行了初步探索，为更好地研究宿主对病毒入侵的应答机制，提高疫苗生产效能提供了研究基础和生物材料储备。 相似文献
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