新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因密码子的优化及原核表达

试验旨在优化新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)XX株σB蛋白的原核表达系统,并评价sσB蛋白的免疫原性。根据已测得的NDRV-XX的σB蛋白基因序列,在不改变氨基酸序列的前提下,按照大肠杆菌密码子偏好性对σB蛋白全基因进行优化、合成并连接至pET-32a(+)质粒中,构建原核表达重组质粒pET-32a(+)-sσB,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达并优化表达条件。SDS-PAGE结果显示,最佳诱导表达时间、温度及IPTG浓度分别为3h、32℃和0.25mmol/L;可溶性分析结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。表达菌经超声破碎、变性、复性和Ni 2+柱亲和层析后,得到纯度高于90%的sσB可溶性蛋白,sσB重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株上的表达量较σB蛋白提升了14.6%,前者占细菌总蛋白量的32.3%。Western blotting结果显示,sσB重组蛋白具备NDRV抗原免疫反应原性。本试验成功构建并优化了NDRV-XX株σB蛋白的原核表达系统,提高了σB蛋白的表达量,并获得具有良好NDRV抗原免疫反应原性的σB重组蛋白,为后续NDRVσB蛋白功能及其应用的深入研究、基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为制备新型鸭呼肠孤病毒（new-type duck reovirus,NDRV）XX株σB蛋白的多克隆抗体,试验经RT-PCR扩增NDRV XX株σB基因编码序列,构建原核表达质粒pET-32a（+）-σB,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后,经IPTG诱导获得His-σB重组蛋白。SDS-PAGE显示成功表达出约55 ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度分别为3 h和0.25 mmol/L。经Ni²⁺柱亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,将蛋白经Western blotting和蛋白质谱鉴定为高纯度的σB重组蛋白,将纯化后σB重组蛋白按合理免疫程序免疫家兔,获得多抗隆抗体经Western blotting分析显示出特异性的反应。本试验结果为NDRV σB蛋白功能的深入研究及基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达及鉴定

为获得大量的猪瘟病毒重组蛋白抗原,本文构建了猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域原核重组表达质粒pET-32a(+)-ABCD,对该重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达产量进行了比较分析,并采用胶体金免疫层析和蛋白质免疫印迹鉴定重组蛋白的反应原性。结果表明重组质粒pET-32a(+)-ABCD在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中均可以获得可溶性表达,目的蛋白表达量分别占总蛋白量的比例为11.4%和19.7%,大肠杆菌Rosseta(DE3)作为表达宿主菌更高效,且重组蛋白具有反应原性。该研究为猪瘟病毒重组蛋白抗原的制备提供了参考。     

新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为制备新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)XX株σB蛋白的多克隆抗体,试验经RT-PCR扩增NDRV XX株σB基因编码序列,构建原核表达质粒pET-32a(+)-σB,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得His-σB重组蛋白。SDS-PAGE显示成功表达出约55ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度分别为3h和0.25mmol/L。经Ni 2+柱亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,将蛋白经Western blotting和蛋白质谱鉴定为高纯度的σB重组蛋白,将纯化后σB重组蛋白按合理免疫程序免疫家兔,获得多抗隆抗体经Western blotting分析显示出特异性的反应。本试验结果为NDRVσB蛋白功能的深入研究及基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）N蛋白,通过PCR扩增获得PEDV的N基因片段与载体pET-32a（+）相连构建原核表达载体pET-32a（+）-PEDV-N。将构建成功的质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG（1 mmol/mL）37℃诱导表达后,采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况,对影响重组蛋白表达的诱导时间进行分析。利用Western blot方法分别检测重组蛋白的免疫原性。结果表明：PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测发现条带位置正确,重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N测序正确,含有重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N的表达菌株BL21（DE3）在诱导表达后,经SDS-PAGE检测证明有重组蛋白表达,利用Western blot结果表明该重组蛋白与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,说明成功制备了PEDV-N重组蛋白。     

新型鸭呼肠孤病毒DH13株结构蛋白σB的原核表达及免疫原性分析

本研究旨在利用原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒（NDRV） DH13株重组σB蛋白,并检测其免疫原性,为NDRV基因工程疫苗研制等提供物质材料。采用RT-PCR方法扩增获得NDRV σB基因,构建原核表达重组质粒pET-30a-σB和pET-32a-σB,将2个重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。纯化无His的σB蛋白,并以此蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,制备兔源多克隆抗体。利用Ni²⁺柱亲和层析法纯化含His的σB蛋白,以此蛋白作为检测原,通过间接ELISA方法测定兔源多克隆抗体效价;Western blotting鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性识别能力。结果显示,PCR扩增获得大小约为1 100 bp的σB基因片段。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了2种重组σB蛋白,大小分别约为41和46 ku,均以包涵体形式存在。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶204 800,能特异性地识别原核表达的重组蛋白,表明重组无His的σB蛋白具有良好的免疫原性。Western blotting特异性鉴定结果显示,含His的σB蛋白和无His的σB蛋白均与制备的兔源多克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达得到的重组σB蛋白具备良好的反应原性。本试验利用原核表达系统成功地表达出了重组σB蛋白,并证实了重组NDRV σB蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该结果将有助于后续对NDRV σB蛋白生物学功能的鉴定、NDRV诊断用抗原的制备及NDRV新型疫苗的研制。     

鸡肠炎沙门氏菌ompA基因的克隆与表达

根据GenBank中鸡肠炎沙门氏菌ompA基因序列设计1对引物,以鸡肠炎沙门氏菌贵州分离株基因组为模板,扩增鸡肠炎沙门氏菌ompA基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-ompA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了鸡肠炎沙门氏菌ompA蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE分析结果表明, 该重组蛋白的分子质量约为55 ku,可溶性分析结果表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白具备免疫原性。     

新型鸭呼肠孤病毒DH13株σC蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在建立新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）σC蛋白的原核表达系统,制备σC蛋白的多克隆抗体,并评估所制备抗体的效价。通过RT-PCR方法扩增获得NDRV DH13株σC基因,连接至pET-30a（+）及pET-32a（+）载体中,构建原核表达质粒,并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导获得两种σC重组蛋白,经SDS-PAGE分析蛋白表达形式。利用切胶方法纯化不含His标签σC重组蛋白,利用Ni-NTA柱纯化含His标签σC重组蛋白。以纯化的无His标签蛋白为免疫原免疫兔子获得兔抗σC多克隆抗体,Western blotting分别使用抗His标签的单克隆抗体和NDRV-σC蛋白阳性血清两种一抗评估抗体的特异性,间接ELISA（iELISA）检测抗体滴度。SDS-PAGE结果显示获得34和37 ku两种重组蛋白,且均得到高效表达。Western blotting结果显示制备的多克隆抗体具有良好的特异性,所制备的抗体与σC蛋白亲和力较好。间接ELISA检测结果显示其效价达1：25 600。本试验成功构建σC蛋白的原核表达系统,制备的σC蛋白多克隆抗体为深入研究σC蛋白的生物学功能及开展NDRV基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

犬细小病毒VP2截短基因的原核表达及表达蛋白抗原性分析

采用PCR方法扩增了犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）2段VP2截短基因,将2段短基因片段分别克隆至原核表达载体pET-32a（＋）中,表达质粒命名为pET-32a-306和pET-32a-363。将pET-32a-306和pET-32a一363转化至宿主菌E．coliBL21（DE3）,IPTG诱导后进行SD孓PAGE和Westernblotting分析。结果显示,融合蛋白相对分子质量大小为30000和33000;与全长VP2蛋白相比,目的蛋白得到了高效表达,且都为可溶性表达。West—ernblotting结果表明,该蛋白融合表达并且有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。     

携带猪流行性腹泻病毒S1抗原表位的乙肝核心抗原病毒样颗粒的构建与鉴定

旨在构建以乙肝核心抗原（HBcAg）为载体呈现猪流行性腹泻病毒（PEDV）S1抗原表位的病毒样颗粒。将PEDV S1蛋白中含B细胞表位的270 bp片段插入到HBcAg主要免疫显性区域（MIR）,构建重组质粒pET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1,转化到感受态细胞BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定纯化后的重组蛋白,通过透射电镜观察其形态结构。结果显示,成功构建重组质粒pET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1,并在BL21（DE3）中以包涵体形式表达,纯化、复性后的重组蛋白经过2%磷钨酸负染后透射电子显微镜检测到病毒样颗粒结构。HBcAg-PEDV S1重组蛋白能够自发形成病毒样颗粒,在原核表达中,乙肝核心抗原可作为载体呈现PEDV S1抗原表位,为今后新型PED疫苗的研究提供了思路。     

胸膜莫肺炎放线杆菌APXIV部分基因片段的表达及纯化

参照GenBank中已发表的ApxⅣ基因序列,以自行分离的AppDNA为模板,利用PCR方法扩增出ApxⅣ3’端,大小为552bp的保守基因序列。将PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector中,获得重组质粒pMD-ApxⅣ,对其重组质粒pMD-ApxⅣ进行BamHI、HindIII双酶切,并将酶切产物克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建了重组表达质粒pET-ApxⅣ。将表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明pET-ApxⅣ在BL21中成功表达,并能被App阳性血清所识别,具有良好的免疫原性。表达蛋白的分子质量约为39.5KDa。利用HiTrapFFcrude columns将表达的蛋白进行了纯化。     

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of σC Protein of Novel Duck Reovirus DH13 Strain

The aims of the experiment was to optimize the prokaryotic expression system of σC protein,prepare polyclonal antibody against σC protein of novel duck reovirus (NDRV),and evaluate the titer of the antibody.The σC gene of NDRV-DH13 strain was amplified by RT-PCR,ligated into pET-30a(+) and pET-32a(+) expression vector,constructed prokaryotic expression plasmid,which were transformed into E.coli BL21(DE3) and the expression of the σC protein were induced by IPTG.The proteins expression were analyzed by SDS-PAGE.The recombinant protein without His tag was purified by digestion,and the recombinant protein with His-tagged was purified by Ni-NTA column.Then the polyclonal antibody was obtained from rabbits which had been immunized by the purified protein without His tag.Anti-His-labeled mAb and NDRV-σC positive serum were used as primary antibodies to evaluate antibodies specificity,the antibodies titer was detected by indirect ELISA (iELISA).SDS-PAGE results showed that the molecular weight of the expression on recombinant proteins were 34 and 37 ku respectively,the proteins were highly expression.Western blotting showed that they had the specific reaction and the prepared antibodies had higher affinity with σC protein,the titer were about 1:25 600 by iELISA detection.This study successfully constructed and optimized the prokaryotic expression system of the polyclonal antibody against σC protein,laid a foundation for the further study of σC protein and the research of genetically engineered vaccine.     

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因生物信息学分析及可溶性表达

为了获得牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因的最佳可溶性蛋白,本试验根据GenBank已公布的BVDV E2基因序列,利用DNAStar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后合成并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-Opti-E2;转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经SDS-PAGE和Western blot分析,成功获得大小为43 kDa的BVDV E2基因的最佳可溶性蛋白,且该蛋白特异性较好。本试验E2蛋白的成功表达可为后续ELISA方法的建立和亚单位疫苗的开发奠定基础。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

猪脑心肌炎病毒GXLC株VP1基因的原核表达及鉴定

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株的基因组序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增EMCV VPl基因目的片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了EMCV VPl基因重组表达质粒pET-32a-VP1.将pET-32a-VP1转化BL21(DE3)株感受态细胞,并用IPTG进行诱导表达.结...     

鸡CD4基因片段原核表达及其单抗制备

将PCR扩增的鸡CD4基因片段克隆到pET-32a原核表达载体,构建获得原核表达重组载体pET-32a-CD4.重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和树脂纯化获得融合蛋白His-CD4.以此融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤细胞技术制备了1株能够稳定传代并分泌抗CD4多肽单抗的杂交瘤细胞株,命名为3E12.经检测该抗体亚类为IgG2b,单抗腹水的间接ELISA效价为1:105,Western blot结果显示单抗与CD4多肽能特异性地结合.