新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因密码子的优化及原核表达

试验旨在优化新型鸭呼肠孤病毒（new-type duck reovirus,NDRV）XX株σB蛋白的原核表达系统,并评价sσB蛋白的免疫原性。根据已测得的NDRV-XX的σB蛋白基因序列,在不改变氨基酸序列的前提下,按照大肠杆菌密码子偏好性对σB蛋白全基因进行优化、合成并连接至pET-32a（+）质粒中,构建原核表达重组质粒pET-32a（+）-sσB,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达并优化表达条件。SDS-PAGE结果显示,最佳诱导表达时间、温度及IPTG浓度分别为3 h、32℃和0.25 mmol/L;可溶性分析结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。表达菌经超声破碎、变性、复性和Ni²⁺柱亲和层析后,得到纯度高于90%的sσB可溶性蛋白,sσB重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株上的表达量较σB蛋白提升了14.6%,前者占细菌总蛋白量的32.3%。Western blotting结果显示,sσB重组蛋白具备NDRV抗原免疫反应原性。本试验成功构建并优化了NDRV-XX株σB蛋白的原核表达系统,提高了σB蛋白的表达量,并获得具有良好NDRV抗原免疫反应原性的σB重组蛋白,为后续NDRV σB蛋白功能及其应用的深入研究、基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达及鉴定

为获得大量的猪瘟病毒重组蛋白抗原,本文构建了猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域原核重组表达质粒pET-32a(+)-ABCD,对该重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达产量进行了比较分析,并采用胶体金免疫层析和蛋白质免疫印迹鉴定重组蛋白的反应原性。结果表明重组质粒pET-32a(+)-ABCD在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中均可以获得可溶性表达,目的蛋白表达量分别占总蛋白量的比例为11.4%和19.7%,大肠杆菌Rosseta(DE3)作为表达宿主菌更高效,且重组蛋白具有反应原性。该研究为猪瘟病毒重组蛋白抗原的制备提供了参考。     

新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为制备新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)XX株σB蛋白的多克隆抗体,试验经RT-PCR扩增NDRV XX株σB基因编码序列,构建原核表达质粒pET-32a(+)-σB,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得His-σB重组蛋白。SDS-PAGE显示成功表达出约55ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度分别为3h和0.25mmol/L。经Ni 2+柱亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,将蛋白经Western blotting和蛋白质谱鉴定为高纯度的σB重组蛋白,将纯化后σB重组蛋白按合理免疫程序免疫家兔,获得多抗隆抗体经Western blotting分析显示出特异性的反应。本试验结果为NDRVσB蛋白功能的深入研究及基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

犬细小病毒VP2主要抗原表位基因的密码子优化及原核表达

为了制备大量廉价的可溶性犬细小病毒(CPV)VP2蛋白抗原,试验截选了VP2抗原表位集中的基因片段VP2-70进行密码子优化及合成,将合成基因克隆到pET-32a(+)载体中,构建原核表达载体pET-32-VP2-70,转化BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达后进行Ni-NTA亲和层析纯化,Western-blot检测验证其生物学活性。结果表明:试验构建的VP2-70表达载体能够介导VP2-70融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达量高出野生型VP2-70融合蛋白16 mg/L;Western-blot检测显示,该蛋白具有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。     

鸡肠炎沙门氏菌ompA基因的克隆与表达

根据GenBank中鸡肠炎沙门氏菌ompA基因序列设计1对引物,以鸡肠炎沙门氏菌贵州分离株基因组为模板,扩增鸡肠炎沙门氏菌ompA基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-ompA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了鸡肠炎沙门氏菌ompA蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE分析结果表明, 该重组蛋白的分子质量约为55 ku,可溶性分析结果表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白具备免疫原性。     

犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。     

新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为制备新型鸭呼肠孤病毒（new-type duck reovirus,NDRV）XX株σB蛋白的多克隆抗体,试验经RT-PCR扩增NDRV XX株σB基因编码序列,构建原核表达质粒pET-32a（+）-σB,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后,经IPTG诱导获得His-σB重组蛋白。SDS-PAGE显示成功表达出约55 ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度分别为3 h和0.25 mmol/L。经Ni²⁺柱亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,将蛋白经Western blotting和蛋白质谱鉴定为高纯度的σB重组蛋白,将纯化后σB重组蛋白按合理免疫程序免疫家兔,获得多抗隆抗体经Western blotting分析显示出特异性的反应。本试验结果为NDRV σB蛋白功能的深入研究及基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白的表达及其免疫原性分析

运用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白(CPEP)基因,克隆至pMD-19T载体。经鉴定测序验证后,将获得的CPEP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建原核表达质粒pET-32a-CPEP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE以及Western blot分析免疫原性,纯化CPEP,并用纯化的蛋白免疫小鼠,检测其特异性血清IgG抗体水平及攻毒保护率。结果显示,成功构建原核表达质粒pET-32aCPEP;SDS-PAGE分析结果显示,得到约35ku的蛋白;Western blot分析显示,CPEP能与Hps SC-1阳性血清发生抗原抗体的特异性反应,证实该重组CPEP蛋白具有反应原性。以致死剂量的强毒株SC-1攻毒CPEP免疫小鼠,重组蛋白的免疫能够减缓发病,并表现出40%的保护率。重组蛋白CPEP的部分保护作用表明其可以作为免疫候选因子,为未来副猪嗜血杆菌标准化疫苗的研制奠定基础。     

新城疫病毒F抗原表位片段的原核表达及鉴定

为了获得部分具备有效免疫原性的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F蛋白,试验采用RT-PCR方法获得大小为564 bp的含NDV F蛋白部分抗原表位的特异性片段,将其与pET-32a(+)原核表达载体连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过改变诱导时间及IPTG浓度摸索其最佳诱导条件。重组蛋白超声破碎后,沉淀用1%TritonX-100磷酸盐缓冲液洗涤以去除蛋白碎片及膜蛋白。蛋白经尿素变性后采用Ni-NTA agrose纯化,再用梯度透析法复性,最后用Western-blot方法鉴定蛋白的反应原性。结果表明:通过酶切和测序证实pET-32a-F阳性重组质粒构建成功,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为38 ku,确定诱导时间4 h、IPTG浓度0.4 mmol/L为最佳诱导条件,Western-blot检测证实纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。说明纯化蛋白具有与全病毒相似的生物活性。     

猪圆环病毒2型CC株ORF3基因的克隆与原核表达

为原核表达猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF3编码蛋白,本研究采用PCR方法以PCV2的CC株的基因组DNA为模板扩增ORF3基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白约为31ku,并且以包涵体形式存在;western blot分析表明,ORF3重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达的ORF3重组蛋白具有良好的反应原性.     

牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)核蛋白基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化与鉴定

利用RT-PCR方法扩增出牛呼吸道合胞体病毒(BRV)核蛋白基因(N)中1 176bp的特异性片段,将目的片段定向克隆到pET-32a(+)原核表达载体,转化BL21(DE3)表达菌;经IPTG进行诱导,并探讨IPTG浓度、诱导时间对重组蛋白的影响。表达的大肠杆菌超声破碎后,沉淀物用含有1%TritonX-100的PBS溶液洗去膜碎片和膜蛋白。在尿素变性条件下,用镍柱亲和层析法纯化NP包涵体,并通过梯度透析方法进行透析复性,Western blot检测目的蛋白的反应原性。结果显示,酶切和测序成功构建阳性重组质粒,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后发现该重组蛋白主要以包涵体形式存在于细菌中,大小约为60 000,最佳诱导条件为0.000 8 mol/L IPTG诱导4h。通过BCA法测定镍柱纯化的N蛋白质量浓度为0.534g/L,复性后质量浓度为0.397g/L。Western blot检测表明N蛋白具有反应原性。结果表明,在大肠杆菌中成功表达并纯化出N蛋白,并通过复性获得具有反应原性的N蛋白,为N蛋白下一步的应用奠定基础。     

牛诱导型热休克蛋白72多克隆抗体的制备

将扩增的诱导型Hsp72的部分基因片段克隆到pMD-18Tvector中测序。将阳性克隆的PCR产物克隆到质粒pET-32a-c(+)中,并将重组表达载体转化E.coliBL21(DE3)。重组表达载体酶切鉴定,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达有活性的可溶性蛋白。采用纯化后的Hsp72免疫家兔,制备抗血清,Western-blot检测重组抗原的反应原性。Western-blot检测证明,所制备的多克隆抗体可以与Hsp72特异性结合。     

H9N2禽流感病毒HA蛋白的原核表达与鉴定

为了实现H9N2亚型禽流感病毒的HA基因在原核系统中高效表达,试验参考GenBank发布的禽流感病毒A/chicken/Gansu/2/99(H9N2) HA基因序列(登录号为EF070733.1),优化该密码子,化学合成HA基因,并将该基因连接至pET-28a(+)质粒载体中,构建pET-28a(+)-HA重组质粒,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后诱导表达,并优化诱导温度(16,25,30,37℃)、IPTG诱导浓度(0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/L)及诱导时间(2,4,6,8,10 h),用His-tag镍柱亲和层析纯化HA蛋白,并对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定。结果表明:成功构建重组基因工程菌pET-28a(+)-HA/BL21(DE3),其在30℃条件下,添加IPTG终浓度为0.8 mmol/L,诱导6 h时,HA重组蛋白表达量最佳。经His-tag镍柱纯化后在预期的63 ku处出现蛋白印迹条带。说明HA蛋白在大肠杆菌中成功表达。     

猪圆环病毒3型河北株Cap蛋白的原核表达与鉴定

为了制备猪圆环病毒3型cap蛋白,依据NCBI发表的PCV3全基因序列(MK105924)设计了一对特异性引物,通过PCR方法获取PCV3-CAP蛋白基因,将纯化的PCV3-CAP蛋白基因插入到pET-32a(+)质粒中构建重组质粒pET-32a(+)-PCV3-Cap,将构建成功的质粒转化到表达菌株BL21(DE3),经1mmol/mL的IPTG 37℃诱导表达后,利用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况,利用Western blot方法分别检测重组蛋白的免疫原性,对影响重组蛋白表达的IPTG浓度和诱导时间进行分析。结果表明:PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测发现条带位置正确,重组质粒pET-32a(+)-PCV3-Cap测序正确,含有重组质粒pET-32a(+)-PCV3-Cap的表达菌株BL21(DE3)在诱导表达后,经SDS-PAGE检测证明有重组蛋白表达,重组蛋白主要以Wes TM全自动蛋白表达分析系统结果表明该重组蛋白与PCV3多克隆抗体发生特异性反应,说明成功制备了PCV3 Cap重组蛋白。     

副鸡禽杆菌lpxM蛋白的原核表达及免疫原性研究

【目的】探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。【方法】构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。【结果】重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和...     

福氏志贺菌多重耐药调节蛋白MarA的原核表达

为获得福氏志贺菌多种耐药调节蛋白MarA,将扩增出的marA基因亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,经PCR和双酶切鉴定以及序列测定,重组质粒构建成功。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,表达的蛋白再经Ni-NTA亲和层析纯化,结果显示,MarA蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.2%,经Western-bloting检测,表达的蛋白能被福氏志贺菌阳性血清特异识别,说明表达蛋白具有良好的免疫反应性。     

猪戊型肝炎病毒ORF3基因的克隆与原核表达

为了表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行研究,采用RT-PCR方法扩增猪戊型肝炎病毒(SHEV)ORF3完整基因,将扩增产物插入pMD19-T载体,再亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了pET-32a(+)-ORF3表达载体,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,同时对诱导表达条件进行筛选,并用SDS-PAGE和免疫印迹等方法分析鉴定表达产物。结果表明,成功扩增到345bp的目的基因片段,表达载体pET-32a(+)-ORF3转入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,成功表达了ORF3基因编码的蛋白,当IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为6h时,该基因在E.coli BL21(DE3)中表达量最高。表达产物的分子质量约为29.6ku,与预期目的蛋白分子质量相符。表达的蛋白既有包涵体形式,也有可溶性形式。经Western blot检测,表达的目的蛋白能与SHEV阳性血清发生特异性反应。     

重组鹅IFN-α在大肠杆菌中的表达及抗血清制备

为了研究鹅α干扰素(goIFN-α)基因原核表达产物的反应原性并进行goIFN-α抗血清的制备,试验首先根据大肠杆菌偏爱密码子对goIFN-α基因进行优化,随后采用PCR方法扩增goIFN-α编码序列并进行同源性分析。将goIFN-α片段与表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pET-28a-goIFN-α,然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western-blot检测。通过切胶回收的方法回收目的条带,将碾碎的蛋白胶与PBS混合后注入小鼠体内,15 d后回收血清进行Western-blot检测。结果表明:试验成功扩增出goIFN-α基因;与多种IFN-α基因序列进行比较,goIFN-α基因氨基酸序列的同源性为92.5%～98.1%;随后成功构建出重组表达质粒pET-28a-goIFN-α,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,重组蛋白goIFN-α的分子质量约为18 ku,具有良好的反应原性;回收血清进行Western-blot检测,鼠抗goIFN-α血清制备成功。说明重组goIFN-α蛋白能够在大肠杆菌中表达,大小符合预期且具有良好的反应原性,并成功制备出鼠抗goIFN-α血清。     

新型鸭呼肠孤病毒DH13株结构蛋白σB的原核表达及免疫原性分析

本研究旨在利用原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒（NDRV） DH13株重组σB蛋白,并检测其免疫原性,为NDRV基因工程疫苗研制等提供物质材料。采用RT-PCR方法扩增获得NDRV σB基因,构建原核表达重组质粒pET-30a-σB和pET-32a-σB,将2个重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。纯化无His的σB蛋白,并以此蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,制备兔源多克隆抗体。利用Ni²⁺柱亲和层析法纯化含His的σB蛋白,以此蛋白作为检测原,通过间接ELISA方法测定兔源多克隆抗体效价;Western blotting鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性识别能力。结果显示,PCR扩增获得大小约为1 100 bp的σB基因片段。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了2种重组σB蛋白,大小分别约为41和46 ku,均以包涵体形式存在。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶204 800,能特异性地识别原核表达的重组蛋白,表明重组无His的σB蛋白具有良好的免疫原性。Western blotting特异性鉴定结果显示,含His的σB蛋白和无His的σB蛋白均与制备的兔源多克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达得到的重组σB蛋白具备良好的反应原性。本试验利用原核表达系统成功地表达出了重组σB蛋白,并证实了重组NDRV σB蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该结果将有助于后续对NDRV σB蛋白生物学功能的鉴定、NDRV诊断用抗原的制备及NDRV新型疫苗的研制。