超声波介导Mz_2NHX_1基因遗传转化提高珠美海棠耐盐性

【目的】提高珠美海棠的耐盐性,建立更高效的珠美海棠遗传转化体系。【方法】在转化液中利用超声波直接转化无菌条件下横切主脉的珠美海棠试管苗幼叶,通过愈伤组织培养诱导植株再生、抗性筛选,GUS染色鉴定,RT-PCR分析转基因植株的耐盐性。【结果】较利于珠美海棠愈伤组织诱导分化及抗性筛选的培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L~(-1)+NAA 0.1 mg·L~(-1)+Kana 50 mg·L~(-1)。超声波处理的最优工作条件为:处理6 s,间歇10 s,工作重复20次,功率80 W,转化效率为31.3%。GUS染色与RT-PCR鉴定结果一致率为100%,RT-PCR结果分析显示,Mz2NHX1基因在转化苗中的表达量约为对照的3倍。荧光定量PCR结果显示转化苗Mz2NHX1基因的表达量为对照组的6.21倍,盐处理试验结果显示转化苗耐盐性得到了显著地提高。【结论】建立了超声波介导的珠美海棠高效遗传转化体系,获得珠美海棠耐盐新材料,为该耐盐基因的研究和盐碱地的改良奠定了基础。     

珠美海棠耐滨海盐碱及嫁接苹果试验初报

珠美海棠耐滨海盐碱及嫁接苹果试验初报马继龙，崔连明，刘桂荣，李军，郭桂英（山东省寿光市林业局２６２７００）珠美海棠原产日本北部山区，是毛山荆子与三叶海棠的野生自然杂交种。珠美海棠引进后由天津农大赵惠祥教授历经１３年时间、利用组织培养筛选繁育出耐内陆盐...     

盐胁迫对珠美海棠和山定子膜保护酶系统的影响

实验以耐盐种珠美海棠(MaluszumiMats)和盐敏感种山定子[Malusbaccata(L.)Borkh]为试材,比较研究了在盐胁迫下叶片质膜透性、叶绿素和丙二醛(MDA)含量、膜保护酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性及根质膜透性的变化,为探索苹果属植物耐盐机制提供素材。结果表明,盐胁迫对根质膜透性没有明显的影响;但导致叶片质膜透性增加,盐敏感种山定子的质膜透性高于耐盐的珠美海棠。随盐胁迫加重,叶绿素a、b含量降低,叶绿素a/b比值增加,类胡萝卜素变化不明显。MDA含量随盐胁迫而升高,但珠美海棠低于山定子。山定子叶片中SOD、POD、CAT活性随盐胁迫加重而降低,而珠美海棠SOD活性在盐胁迫下保持稳定,POD、CAT活性增高。由此可见珠美海棠在盐胁迫条件下有活性较高的膜保护酶系统。     

西瓜bHLH转录因子家族基因的鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

利用生物信息学方法,在西瓜测序基因组97103中共鉴定出96个bHLH家族成员,其中有94个可以被定位到西瓜的11条染色体上。通过基因结构和结构域序列保守性的预测,发现这些基因的序列长度和内含子数量变化很大,但bHLH结构域序列比较保守。用拟南芥中39条已知的bHLH蛋白序列和西瓜的96条bHLH蛋白序列构建系统发育树,结果显示西瓜的bHLH家族可以进一步被分为11个亚族。运用荧光定量实时PCR技术,分析了该家族中21个基因在西瓜响应非生物胁迫时的表达水平,结果表明,8个基因受低温胁迫诱导表达,13个基因受ABA胁迫诱导表达,14个基因受盐胁迫诱导表达。ClabHLH41在3种胁迫下表达量均显著增加,说明其在低温、ABA和盐胁迫应答中可能发挥着重要作用。     

逆境条件下珠美海棠栽培试验

从珠美海棠的抗旱性。抗盐性及抗涝洼能力几方面进行了试验，结果表明珠美海棠抗旱能力与紫穗槐相近．６，３１％的土壤含水量是其正常生长的下限；珠美海棠抗盐能力强，可在含盐量０．４％的你洼盐碱地上推广应用。     

苹果砧木耐盐性田间鉴定

1997～ 1998年在山东省东营市盐碱地农场分别种植 14种 1年生苹果砧木苗和 6种砧木的1年生嫁接苗 ,发现砧木珠美海棠 ( Malus　 zumi)、小金海棠 ( M.xiaojinensis)耐盐性较强 ;M2 6、MM10 6、M9、八棱海棠 ( M.micromalus)耐盐性中等 ;丽江山定子 ( M.rockii)和 A2不耐盐。不同砧穗组合的耐盐能力主要取决于砧木 ,同一种砧木嫁接不同品种的耐盐性相当。轻度盐碱地育苗、覆膜铺草等栽培措施能提高苹果苗对盐胁迫适应性能力     

“绿宝”苹果与不同砧木嫁接的解剖学研究

以八棱海棠(Mulus robusta)、平顶海棠(M.prunifolia)、圆叶海棠(M.prunifoliavar.ringo)、西府海棠(M.micromalus)、红果海棠(M.sieboldii)和珠美海棠(M.zumi)为砧木,嫁接"绿宝"苹果(M.domestica‘Bramley′s seedling’),对接穗与砧木新梢的解剖结构以及嫁接口的解剖结构进行了观察测定,以了解"绿宝"苹果与不同砧木的嫁接亲和性。结果表明:"绿宝"苹果与八棱海棠、平顶海棠的枝皮率差异不显著,新梢横断面的组织结构相差较小,而与珠美海棠和红果海棠的枝皮率存在显著差异,且组织结构相差较大;"绿宝"苹果嫁接在八棱海棠和平顶海棠上,其嫁接口砧穗的结构差异较小,愈合良好;而嫁接在珠美海棠和红果海棠上,接口砧穗的结构差异较大,愈合较差,砧穗较易分离。综合分析认为,八棱海棠、平顶海棠和圆叶海棠为"绿宝"苹果适宜的嫁接砧木。     

五种苹果砧木的生长及生理特性对盐胁迫的响应

以八棱海棠(Malus robusta)、平顶海棠(Malus prunifolia)、红果海棠(Malus sieboldii)、珠美海棠(Malus zumi)、西府海棠(Malus micromalus)一年生实生苗为试材,对其进行盐胁迫处理,比较其耐盐性差异。结果表明:随盐浓度增加,参试植物的新梢生长量、叶面积和叶片厚度、根系活力降低,盐害率和盐害指数增加,其中八棱海棠的变化幅度最小,红果海棠相对较大;叶绿素(Chl)和类胡萝卜素(Car)含量变化各异,但八棱海棠和平顶海棠的变化较小;参试植株的可溶性糖及丙二醛(MDA)含量均随盐浓度增加呈上升趋势;超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性均受不同程度影响,八棱海棠的SOD活性变化较小;八棱海棠的隶属函数平均值最大,红果海棠的最小。结合其形态表现综合分析认为,5种苹果砧木的耐盐性强弱依次为:八棱海棠、西府海棠、平顶海棠、珠美海棠、红果海棠。     

苹果铁结合蛋白基因的克隆及表达特性

 根据已报道的植物铁结合蛋白基因( ferritin) 的保守区域设计引物, 用RT2PCR 的方法从‘嘎拉’苹果叶片中获得铁结合蛋白基因的全长序列。该基因cDNA共有1 043个碱基, 其中编码区834bp, 编码277个氨基酸残基的蛋白质, 终止密码子后有209 bp左右的3’端尾随序列区。Southern杂交结果显示ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5 mmol·L ^{- 1}的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗不同时间后的定量RT-PCR分析表明, ‘嘎拉’苹果的铁结合蛋白基因随着诱导时间的延长表达量增加, 说明该基因可能在转录水平上受铁诱导表达。     

苹果凹果类病毒(ADFVd)的检测与序列分析

采集新疆焉耆地区的老果园的苹果树枝条、叶片和韧皮部,利用自行设计的方法提取总RNA,根据GenBank中的X99487序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增出苹果凹果类病毒(ADFVd)特异条带,通过回收克隆测序,结果表明,获得的7条序列,有5条同源性很高,均在98%以上,另外2条的同源性只有85%左右,这7条序列均已在GenBank中登录(登录号:EU031497_EU031503)。在此基础上利用插入ADFVd目的DNA的质粒为模板,成功合成了地高辛标记的cDNA探针,该探针能很好地用于ADFVd的检测。同时利用原位RT-PCR技术,做了进一步检测,证明苹果叶片中有苹果凹果类病毒存在,主要分布在叶肉细胞的细胞核中。     

番茄转录因子基因SlWRKY16的克隆及原核表达分析

从栽培番茄（Solanum lycopersicum）‘M82’中克隆到1个WRKY家族基因SlWRKY16。研究结果显示：SlWRKY16包含1 497 bp的完整开放读码框，编码498个氨基酸，理论分子量为55.5 kD，含有1个WRKYGQK保守结构域和C2H2锌指结构域，属于Ⅱb类WRKY转录因子基因，且定位于细胞膜上；栽培番茄SlWRKY16与潘那利番茄SpWRKY6（XP_015064265.1）、马铃薯StWRKY6（XP_006350473.1）同源性最高。qRT-PCR结果显示SlWRKY16在番茄不同组织中均有表达，叶片中的表达量最高；短时间非生物胁迫下该基因的表达量显著降低。此外，重组菌pET-30a-SlWRKY16在NaCl、甘露醇胁迫下生长均明显低于对照菌pET-30a。综上，番茄SlWRKY16基因可能在响应非生物胁迫过程中具有负调控效应。     

柑橘抗逆基因NAC83的克隆与表达分析

以柚[Citrus maxima（Burm.）Merr.]、枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]和柠檬[C. limon（L.）Burm. f.]实生苗为试材,使用电子克隆和RT-PCR的方法从中克隆到3个新的NAC蛋白基因,分别命名为CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83;并用qRT-PCR技术检测了该基因在ABA、干旱、低温和高盐胁迫处理下的时空表达。结果显示：CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83 的cDNA序列全长均为841 bp,都含有750 bp的开放阅读框（ORF）,编码249个氨基酸;推测其蛋白分子质量分别为24.18、28.00和28.15 kD,等电点分别是9.02、9.31和9.30,且均含有NAC家族的N端保守结构域;系统进化树分析表明,该3个蛋白均属于SENU5亚族,与苹果NAC22亲缘关系较近。实时定量qRT-PCR分析显示,NAC83基因能被ABA、干旱、低温和高盐胁迫诱导表达,且在不同的柑橘种类中存在表达差异。可见柚CmNAC83、枳PtNAC83和柠檬ClNAC83是NAC基因家族的成员,可能在柑橘响应非生物胁迫的过程中起了重要作用。     

辣椒抗根结线虫相关WRKY基因的分离

为了确定抗性基因Me3介导表达的抗根结线虫相关WRKY基因的种类及其表达特点,以含Me3基因的辣椒HDA149品种为材料,接种南方根结线虫二龄幼虫,通过同源克隆法获得辣椒4个WRKY新基因片段。利用RT-PCR技术克隆了WRKY-a、WRKY-b、WRKY-c、CaWRKY1、WRKY1和CaWRKY2等 6个WRKY基因的全长cDNA。研究表明,WRKY-a、CaWRKY2基因是受根结线虫诱导表达的;CaWRKY1基因的表达具有组织特异性,在根、叶中表达,在茎中不表达。聚类分析表明WRKY-a、WRKY-c、CaWRKY2蛋白属于第Ⅰ组WRKY蛋白,WRKY-b、CaWRKY1属于第Ⅱc亚组,WRKY1属于第Ⅱa亚组。     

柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析

以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个Cs WRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。     

药用蒲公英低温和高温胁迫下内参基因筛选与相关基因表达分析

为研究不同温度胁迫下药用蒲公英最适内参基因与温度响应相关基因的表达，分别以低温（4 ℃）和高温（38 ℃）胁迫0、3、6、12、24和48 h共12个处理的叶片为材料，选取10个候选内参基因18S、EF1α、TUB、40S、GAPDH、β-actin、ACT11、TUA、60S和SKIP，利用RT-qPCR技术以及geNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价其稳定性。利用筛选出的最适内参基因对药用蒲公英12个温度响应基因（AP2/ERF、Dof、ICE1、MYB、bZIP、NTL6、HSF、Gols、HSP、NAC、XCT和WRKY）的表达水平进行定量分析。结果显示：温度胁迫下药用蒲公英最适内参基因为18S和GAPDH；药用蒲公英AP2/ERF、HSF、Glos、HSP、NAC、XCT基因在低温和高温胁迫下均为先上调后下调表达，bZIP、NTL6在温度胁迫下波动变化，Dof、ICE1、MYB在低温胁迫下先上调后下调表达，高温胁迫下持续下调表达，WRKY在高温胁迫下表达量远远高于低温胁迫。依据基因表达量推测，药用蒲公英低温和高温胁迫的响应机制存在差异，AP2/ERF、Dof主要响应低温胁迫，HSF、XCT、WRKY主要响应高温胁迫。     

三种苹果属植物幼苗拒Na2+机理的研究

 以苹果属耐盐性不同的山定子、小金海棠和珠眉海棠的幼苗为试材，通过拒Na²⁺ 能力的测定确定了盐敏感种的整体拒Na²⁺ 能力为65%左右，中等耐盐种的整体拒Na²⁺ 能力为80%左右，耐盐种的整体拒Na 能力为90%左右，根部和茎基部的拒Na 能力是苹果属植物幼苗整体拒Na²⁺ 能力的主要部分，耐盐种根部和茎基部的拒Na²⁺ 能力明显大于盐敏感种。耐盐种侧根、茎基木质部和老叶的Na²⁺累积效应明显，是主要的聚Na²⁺ 部位。耐盐种通过地上部Na²⁺ 的重新分配和再转运，使幼叶和成熟叶Na²⁺ 含量更低。     

盐胁迫下胡萝卜肉质根中木质素响应机理研究

以‘红福七寸’和‘红芯七寸’胡萝卜为材料,测定了不同浓度Na Cl处理下肉质根木质素含量以及根和叶中胁迫相关的生理指标,并利用实时荧光定量PCR方法测定了13个木质素合成相关基因在肉质根中的表达水平。结果显示:在不同浓度盐胁迫下,胡萝卜肉质根中木质素含量均显著高于对照(蒸馏水处理),且在100 mmol·L-1Na Cl处理下含量最高,为对照的1.91倍(‘红福七寸’)和1.83倍(‘红芯七寸’),表明盐胁迫诱导了胡萝卜肉质根木质素的合成。q RT-PCR和相关性分析结果显示13个木质素合成相关基因中的Dc F5H和Dc COMT表达水平与木质素含量的动态变化相似且高度正相关,可能为盐胁迫下胡萝卜肉质根木质素生物合成响应的关键基因。生理指标测定结果显示,在盐胁迫处理下,胡萝卜根和叶中的超氧化物歧化酶(SOD)活性、脯氨酸和可溶性蛋白含量均有不同程度的响应。本研究结果表明盐胁迫诱导胡萝卜肉质根的木质化,木质素合成通路基因参与了对盐胁迫的响应,Dc F5H和Dc COMT可能是盐胁迫下调控木质素合成的关键基因。     

苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

珠美海棠叶片离体培养与植株再生

将珠美海棠试管苗叶片接种于附加NAA0.3 mg·L-1和不同体积分数的6-BA(1.0～6.0 mg·L-1)的MS培养基中进行离体培养,结果表明,6-BA为1.0～3.0 mg·L-1的处理芽再生率为6.7%～31.8%,而根的再生率为26.7%～28.3%.6-BA为4.5和6.0 mg·L-1处理芽再生率分别高...