苹果蔗糖转运蛋白MdSUT2调控花青苷积累的研究

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆蔗糖转运蛋白基因MdSUT2(序列号:MDP0000277235),该基因包含1 704 bp开放阅读框,编码566个氨基酸,蛋白大小为56 kD。构建MdSUT2表达载体并利用农杆菌介导法侵染拟南芥,半定量RT-PCR证明Md SUT2在拟南芥中异源表达。构建瞬时表达载体,‘红星’苹果进行Md SUT2瞬时表达,其花青苷含量增多,而沉默该基因花青苷含量明显降低。     

炭疽菌诱导的枇杷病程相关基因EjPR1的克隆及其表达分析

以炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)处理的枇杷高抗品种‘Peluches’的叶片为材料,利用RT-PCR和RACE克隆技术,获得枇杷病程相关蛋白1基因的cDNA全长序列,命名为EjPR1。该基因全长为731 bp(GenBank登录号为MN92775),5′端非编码区79 bp,3′端非编码区91 bp。其中ORF阅读框为561 bp,编码186个氨基酸,蛋白质等电点为5.63,分子量为21485.34,其预测结果的理论值与原核表达结果一致。序列分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与其他6种蔷薇科植物PR1蛋白的氨基酸序列相似性在76.41%~94.36%之间。接种炭疽菌后时序表达分析结果表明,该基因在高抗品种‘Peluches’中受病原菌诱导后明显上调表达,在接种后96 h最高,但在高感品种‘森尾早生’中无明显变化,说明EjPR1可能参与了枇杷的抗病防御过程。     

苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF4的分离与功能鉴定

以‘嘎拉’苹果(Malus × domestica‘Royal Gala’)为研究材料,利用同源克隆和PCR技术,分离了苹果细胞分裂素响应因子(cytokinin response factor)基因MdCRF4。该基因开放阅读框(ORF)为1077 bp,编码含有358个氨基酸的蛋白。保守结构域和系统进化树分析显示,MdCRF4蛋白包含一个保守的CRF结构域和一个保守的AP2/ERF结构域,与梨PbCRF4同源性最高。基因表达分析显示,该基因主要在苹果根和叶中表达并且响应细胞分裂素。EMSA试验显示MdCRF4原核表达蛋白能够绑定DRE(ACCGAC)序列。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdCRF4,其花青苷积累显著增加,表明MdCRF4在调控花青苷积累中发挥重要作用。     

苹果6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1的克隆和功能分析

以‘嘎拉’苹果为材料,克隆了6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1(序列号:MDP0000279299)全长。序列分析显示,该基因包含一个长为1 047 bp完整的开放阅读框,编码347个氨基酸,分子量为36.430 k D,预测等电点为9.24。同源性分析表明Md6PGDH1还有另外3个同源基因;功能域分析表明Md6PGDH蛋白含有两个保守的绑定域;亚细胞预测表明Md6PGDH定位存在差异。分析Md6PGDH1启动子发现存在多个响应非生物胁迫的顺式作用元件。定量分析显示,Md6PGDH1在苹果的不同组织中都有表达,且受非生物胁迫诱导。原核诱导Md6PGDH1蛋白并进行蛋白酶活的测定,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。Md6PGDH1在苹果愈伤组织中过量表达,提高其抗盐胁迫的能力。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

1-甲基环丙烯处理对苹果贮藏中可溶性蛋白的影响

采用SDS-PAGE技术,以5个苹果品种为试材,探究1-甲基环丙烯(1-MCP)处理对采后果实中可溶性蛋白的影响。结果表明,对照果实在后熟衰老阶段出现了7个特异蛋白条带,分子量分别为97.2、38.3、37.0、28.7、27.2、19.6和18.6 kD。特异蛋白的变化存在品种间差异,37.0 kD蛋白仅在‘嘎拉’和‘秦冠’苹果中表达;28.7 kD蛋白含量在‘嘎拉’和‘秦冠’苹果中减少,但在其他品种中保持稳定;27.2 kD蛋白在‘嘎拉’苹果中没有表达;18.6 kD蛋白仅在‘新红星’、‘秦冠’和‘富士’苹果中表达。经500 nL·L^-11-MCP处理的果实中97.2、38.3、37.0、27.2、19.6、18.6 kD蛋白的积累被推迟或减少,而‘嘎拉’和‘秦冠’苹果中28.7 kD蛋白的降解被延缓。     

苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)为试材,克隆了乙烯响应因子基因MdERF11(序列号MDP0000756341)。测序发现,该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框,编码161个氨基酸。系统进化树分析表明,这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测,MdERF11启动子序列中含有与脱落酸(ABA)、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdERF11在苹果的各组织中均有表达,在叶柄和果实中表达量相对较高;并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下,MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强,表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）为试材，克隆了乙烯响应因子基因MdERF11（序列号 MDP0000756341）。测序发现，该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框，编码161个氨基酸。系统进化树分析表明，这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测，MdERF11启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明，MdERF11在苹果的各组织中均有表达，在叶柄和果实中表达量相对较高；并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下，MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强，表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

异位表达苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1降低烟草的抗旱性

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了G蛋白偶联受体基因MdGCR1。其开放阅读框(ORF)为960 bp,编码含有319个氨基酸的蛋白。系统进化树分析显示,MdGCR1与梨GCR1亲缘关系最近,同源性最高。基因表达分析显示MdGCR1主要在苹果根、茎和叶中表达,在花和果实中的表达量较低;MdGCR1受多种逆境胁迫诱导,参与多种激素响应。构建了MdGCR1植物过表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得了转MdGCR1烟草。转基因材料抗性试验结果显示:超量表达MdGCR1显著降低烟草对干旱胁迫的抗性,表明苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1在响应植物抗旱胁迫中发挥重要作用。     

苹果组蛋白脱乙酰化酶基因HDA19的生物信息学分析与胁迫响应研究

从‘嘎拉’苹果中克隆了MdHDA19（MDP0000132078）基因。它编码1个脱乙酰化酶,该基因ORF为1 494 bp,编码497个氨基酸,预测其蛋白质分子量为55.73 kD,等电点为4.98。进化树分析表明,HDA19在不同物种间的氨基酸序列保守性较高,其中苹果MdHDA19与可可树TcHDA19亲缘关系最近（87.05%）。MdHDA19表达模式分析显示,其在苹果各个器官中均有表达,尤其在根和花中表达量较高。MdHDA19与苹果中MdSAT18互作,MdHDA19受到盐胁迫诱导,可能参与盐胁迫的调控。MdHDA19表达受低温（4 ℃）和高温（40 ℃）诱导,说明MdHDA19可能参与调控苹果对温度胁迫的响应。并用原核诱导的方法在体外表达了MdHDA19蛋白。     

转基因苹果组培苗铁蛋白基因在转录水平上的表达

以转菜豆铁蛋白基因的嘎拉苹果4个株系的试管苗为材料,通过定量RT-PCR的方法检测外源和内源铁蛋白基因的转录表达量,结果表明苹果转基因植株外源铁蛋白基因的转录表达量与其插入的拷贝数没有明显的关系,可能受插入位点的影响;同时在铁诱导的条件下,外源铁蛋白基因与内源的铁蛋白基因的转录表达特性一致,转录水平受铁的调控,随着铁诱导时间的延长,其mRNA表达水平逐渐增加。对转基因植株的根、茎、叶3个部位铁蛋白基因的转录表达量研究结果表明,外源菜豆铁蛋白基因与内源苹果铁蛋白基因的mRNA含量均在根部最高,茎次之,叶片最低。     

短枝型苹果赤霉素受体基因MdGID1a 及其启动子克隆和表达分析

 以短枝型富士苹果‘龙富短枝’（Malus × domestica Borkh.‘Longfu Duanzhi’）枝条为试材, 采用RT-PCR 结合RACE 技术,克隆获得苹果赤霉素受体基因MdGID1a,GenBank 基因数据库的登录号 为JF516247。该基因编码区共1 035 bp,推测其编码345 个氨基酸。氨基酸序列分析显示,其具有HSL 基因家族的保守氨基酸结构域HGG 和GXSXG,与其它植物赤霉素受体基因具有较高的同源性。其启动 子序列包含植物激素和光等响应元件。实时定量qRT-PCR 分析表明,MdGID1a 在短枝型‘龙富短枝’和 普通型‘长富2 号’枝条不同生长阶段、在叶片、枝条、果实、花和叶芽中的表达水平存在明显差异。 苹果赤霉素受体基因MdGID1a 在短枝型苹果枝条伸长过程中具有一定的调控作用。     

基于ITS和matK序列探讨新疆野苹果与中国苹果的系统演化关系

 以新疆地区不同居群的52份新疆野苹果[Malus sieversii（Ledeb.）Roem.]、9份中国苹果品种（Malus × domestica subsp. chinensis Li.）、1份森林苹果（M. sylvestris Miller）种质为试材,进行核糖体DNA内转录间隔区（ribosomal DNA internal transcribed spacers,ITS）和叶绿体成熟酶K（matK）基因的测序分析。从GenBank中获取了11个苹果栽培品种、14个塞威士苹果、26个苹果属其它种及1个外类群欧洲梨（Pyrus communis）的ITS及matK序列。利用MEGA（ver. 4.0）计算不同序列间的碱基组成频率、简约信息位点数、转换/颠换比率、序列间成对距离,以最大简约法与邻接法进行系统发育分析。结果表明,采集的“新疆野苹果”与“中国苹果”的ITS序列长度在589 ~ 594 bp,含有148个简约信息位点,转换/颠换比率（R）为1.029;MatK序列长度为1 451 ~ 1 461 bp,没有复制子Ⅱ序列,含有16个简约信息位点,转换/颠换为1.442。ITS分析将中国苹果、新疆野苹果（来自中国新疆）和塞威士苹果（来自GenBank）聚类于一个大的发育枝内,新疆野苹果5个居群的系统演化按新源、巩留、霍城和塔城的先后次序发生。MatK序列的系统发育分析将中国苹果和新疆野苹果聚类在一个大的发育枝内,但自展支持率低。由此说明,中国苹果由新疆野苹果驯化而来。matK不适于栽培苹果种内的系统发育分析。     

苹果光敏色素作用因子基因PIF 的克隆和分析

 以短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得一个光敏色素作用因子（PIF）基因,命名为MdPIF。该基因编码区共2 142 bp,推测其编码713个氨基酸。氨基酸序列分析显示,在其C端具有保守氨基酸结构域bHLH,N端具有光敏色素结合域APB,与其它植物光敏色素结合因子有很高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明,在花后20 ~ 110 d,MdPIF在短枝型和非短枝型苹果枝条均能表达,同一生长时期,短枝型苹果枝条的表达量显著低于非短枝型,说明苹果短枝性状可能与MdPIF的差异表达有关。MdPIF在叶片、枝条、花瓣、果实和芽中均能表达,在不同器官中的表达量存在明显差异,在枝条中相对表达量最高,推测其可能主要调控苹果枝条的伸长。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

砂梨扩展蛋白基因cDNA克隆及全序列分析

设计植物EXP扩展蛋白简并引物,以砂梨果实cDNA为模板,克隆得到EXP基因cDNA片段,该片段长465 bp。根据该片段序列,分别设计2条5’和3’末端扩增的特异引物,利用RACE技术,获得了该片段的5’端和3’端序列。用DNAMAN5.22软件对3个序列进行拼接和分析,获得了该基因的cDNA全长,命名为Pyp-EXP。该cDNA全长为1 395 bp,5’端起始密码子ATG始于72 bp,3’端终止子TAG止于830 bp,Ploy+(A)从1 363～1 395 bp。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EF602031。Pyp-EXP核苷酸序列有一个759 bp完整的开放阅读框,编码区与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃的同源性分别为96%,96%,94%和86%;该cDNA推导编码252个氨基酸,含有1个组氨酸(His_Phe_Asp,HFD)功能域,与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃中相应序列同源性分别为98%,97%,95%和93%。该基因的克隆为研究扩展蛋白的时空表达及其在果实发育和成熟过程中的作用奠定了基础。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。