间接竞争时间分辨荧光免疫分析法检测稻米中Cry1C毒素

利用免疫新西兰大白兔制备Cry1C毒素多克隆抗体,建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析(CI-TRFIA)方法,用于稻米中Cry1C毒素的残留检测。通过4次免疫,采集Cry1C毒素多克隆抗体血清,并用饱和硫酸铵沉淀和Protein A柱纯化,测定抗体效价;以制备Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为检测抗体,建立Cry1C毒素的CI-TRFIA检测方法,并进行抗原类似物的特异性分析和Cry1C毒素在稻米中的添加回收试验。结果表明:获得的多克隆抗体质量浓度为3.86 mg·mL-1,效价为1∶48 000;建立的CI-TRFIA检测方法,其灵敏度(IC10)为0.074 ng·mL-1,中抑制浓度(IC50)为60.16 ng·mL-1,线性检测范围(IC20~IC80)为0.96~1 633.60 ng·mL-1;对Cry1B、Cry1Ab和Cry1Ac均有一定的交叉反应;添加回收试验的批内、批间回收率为84.53%~107.12%,变异系数为6.05%~11.24%。结论:该检测方法稳定性和重复性较好,可以满足Cry1C毒素的检测要求。     

间接竞争时间分辨荧光免疫分析法检测稻米中Cry1C毒素

利用免疫新西兰大白兔制备Cry1C毒素多克隆抗体,建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析(CI-TRFIA)方法,用于稻米中Cry1C毒素的残留检测。通过4次免疫,采集Cry1C毒素多克隆抗体血清,并用饱和硫酸铵沉淀和Protein A柱纯化,测定抗体效价;以制备Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为检测抗体,建立Cry1C毒素的CI-TRFIA检测方法,并进行抗原类似物的特异性分析和Cry1C毒素在稻米中的添加回收试验。结果表明:获得的多克隆抗体质量浓度为3.86 mg·mL-1,效价为1∶48 000;建立的CI-TRFIA检测方法,其灵敏度(IC10)为0.074 ng·mL-1,中抑制浓度(IC50)为60.16 ng·mL-1,线性检测范围(IC20~IC80)为0.96~1 633.60 ng·mL-1;对Cry1B、Cry1Ab和Cry1Ac均有一定的交叉反应;添加回收试验的批内、批间回收率为84.53%~107.12%,变异系数为6.05%~11.24%。结论:该检测方法稳定性和重复性较好,可以满足Cry1C毒素的检测要求。     

基于双抗夹心的Cry1B毒素蛋白质TRFIA检测方法的建立与评价

为了建立检测Cry1B毒素蛋白质的双抗夹心时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法,利用稀土元素Eu3+作为示踪剂,以可溶性表达的抗Cry1B毒素蛋白质单链抗体(scFv)作为捕获抗体,以免疫兔血清获得的抗Cry1B毒素蛋白质多克隆抗体为检测抗体,建立检测Cry1B抗原的TRFIA技术,并对其进行方法学的综合评价。通过正交试验,获得的最佳单链抗体(Capture antibody)、多克隆抗体(Detection antibody)、Eu3+标记的二抗(Tracer antibody)浓度分别是2.500μg/ml、2.000μg/ml、1.000μg/ml。标准检测曲线灵敏度为0.170 ng/ml,线性测量范围为1.000～800.000 ng/ml。抗原类似物间无交叉反应。Cry1B毒蛋白质在大米中添加回收的批内变异系数为3.8%～6.6%、平均回收率为80.5%～84.8%,批间变异系数为2.2%～8.5%、平均回收率为84.1%～88.4%。表明本试验建立的双抗夹心Cry1B-TRFIA检测范围宽,特异性强,重复性和稳定性好。     

抗Cry1F毒素单链抗体的筛选及初步应用

对扩增的Tomlinson I噬菌体抗体库进行3轮特异性富集,挑取单菌落,采用ELISA、PCR及测序比对分析鉴定阳性噬菌体单链抗体(sc Fv);以宿主替换的方式将阳性噬菌体sc Fv基因导入Escherichia coli HB2151中进行可溶性表达,sc Fv过柱纯化后,建立针对Cry1 F毒素的IC-ELISA检测方法。以Cry1 B、Cry1 C、Cry1 Ab、Cry1 Ac作为竞争抑制物,分析sc Fv的特异性,以Cry1 F毒素在玉米中的添加回收试验评价检测方法的实用性。结果显示,从第3轮富集库中筛选到了11株具有Cry1F毒素结合活性的噬菌体sc Fv菌株,经PCR鉴定都含有目的条带,对其中2株(H1、G9)进行测序,证实为人源化的sc Fv。选取G9号阳性噬菌体sc Fv进行可溶性表达,纯化后收集到的sc Fv浓度为256μg/ml。建立的IC-ELISA检测方法检测灵敏度(IC10)为5.99 ng/ml,抑制中浓度(IC50)为0.410μg/ml,线性检测范围(IC20~IC80)为0.107~0.713μg/ml。sc Fv(G9)对Cry1B、Cry1C具有一定结合活性,交叉反应率分别达到了20.92%和15.59%,但不识别Cry1Ab和Cry1Ac,交叉反应率均低于0.1%。添加回收试验结果表明,基于sc Fv(G9)建立的IC-ELISA检测方法稳定性和重复性都比较好。     

利用基因工程抗体建立的新型双抗夹心ELISA法检测Cry1Ac毒素

为明确新型双抗夹心ELISA方法检测Cry1Ac毒素的效果,分别用纯化后的抗Cry1Ac单链抗体和anti-Cry1Ac兔多克隆血清(Anti-Cry1Ac-PAbs)作为捕获抗体和检测抗体,通过方阵滴定确定其最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA法。再用优化后的双抗夹心ELISA方法对检测Cry1Ac毒素的敏感性、特异性和回收率进行鉴定。结果表明,新型双抗夹心ELISA法最低检测限为0.91 ng/ml,线性检测范围为1.04 ng/ml~3.49μg/ml。5种稻米中Cry1Ac毒素的平均回收率为69.42%~87.95%,变异系数为1.19%~6.50%。     

T-2毒素完全抗原制备及免疫学检测方法的建立

为建立小分子霉菌毒素中T-2毒素残留的检测方法,合成并鉴定T-2毒素完全抗原,通过制备敏感性强的抗T-2毒素多抗血清,建立T-2毒素免疫学检测方法。采用N,N'-羰基二咪唑(CDI)法合成完全抗原T-2-BSA和包被原T-2-OVA,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和动物免疫试验对合成的完全抗原进行鉴定,优化ELISA反应条件,建立T-2毒素间接竞争ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,完全抗原T-2-BSA合成成功;动物试验结果显示,制备的完全抗原能够刺激小鼠产生针对T-2毒素的特异性抗体;基于该抗体所建立的T-2毒素间接竞争ELISA检测方法的灵敏度(IC50)为8.34 ng/m L,检测限(LOD)为0.048 ng/m L。综上,成功合成了完全抗原T-2-BSA,获得了效价高、敏感性强的抗T-2毒素的鼠源多克隆抗体,并初步建立了T-2毒素免疫学检测方法。     

基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定

【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”,Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为“检测抗体”,建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔 OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol•L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为“捕获抗体”,多抗为“检测抗体”,建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25-2.43 μg•mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng•mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。     

食品中黄曲霉毒素B_1 ELISA试剂盒检测方法的建立及验证

建立了黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒检测的方法,并通过对食用油、花生、谷物中黄曲霉毒素B1测定进行验证。结果表明,在25℃条件下加入50μL标准品溶液、50μL抗体工作液、50μL酶标二抗反应30 min变异性最小;ELISA试剂盒检测灵敏度高,对食用油、谷物、花生样品中黄曲霉毒素B1最低检测限分别为88.82 ng/L和48.51、176.56 ng/kg;平均回收率和变异系数符合相关规定;与高效液相色谱法相比,检测结果一致。     

莱克多巴胺钐标记时间分辨荧光免疫分析方法的建立

基于抗莱克多巴胺(SAL)的单克隆抗体,初步建立了检测SAL的高灵敏度时间分辨直接竞争免疫分析法(CD-TRFIA)。采用辛酸-硫酸铵纯化抗SAL杂交瘤细胞株腹水单克隆抗体,用稀土离子Sm~(3+)偶联物进行标记,制备钐标抗体;通过合成SAL-SUC半抗原并与卵清蛋白偶联获得SAL-OVA包被抗原;采用直接竞争的方式,游离SAL和固相SAL-OVA包被原共同竞争有限的钐标SAL单抗,初步建立SAL时间分辨免疫分析方法。研究发现,优化的TRFIA半抑制量IC_(50)为1.6 ng/m L,检测范围为0.39~12.77 ng/m L,最低检测限为0.136 ng/m L。     

伏马毒素B1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA方法的建立

采用戊二醛法将半抗原伏马毒素B1分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）和蛋白卵清白蛋白（OVA）偶联成为完全抗原KLH-FB1和OVA-FB1。OVA-FB1作为包被抗原建立ELISA方法;KLH-FB1作为免疫原免疫8周龄Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体。经三次亚克隆后,筛选出两株（6H3,6H11）能特异、稳定分泌抗FB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选择其中一株杂交瘤细胞通过体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体,经检测表明单克隆抗体的亚型为IgG1,轻链为κ型。采用间接ELISA测得腹水纯化后效价达l∶16 000,抗体对伏马毒素的半数阻断浓度（IC50）为8.26 ng/mL,对玉米赤霉烯酮、黄曲霉素B1等结构类似物几乎不存在交叉反应,与其他结构的氯丙嗪、链霉素等无交叉反应。利用获得的抗FB1单克隆抗体,建立了间接竞争ELISA检测方法,检测灵敏度为0.44 ng/mL,检测线性范围为0.93~73.06 ng/mL,加标回收率在线性范围内达到回收率可达78.4%~102%。     

化学发光间接竞争ELISA检测伏马毒素B1方法的建立

采用自制的抗伏马毒素B1(FB1)多克隆抗体,建立定量检测玉米中FB1的化学发光间接竞争ELISA方法。通过化学偶联分别获得免疫抗原钥孔血蓝蛋白(KLH)-FB1和包被抗原卵清蛋白(OVA)-FB1。用KLH-FB1免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。以OVA-FB1为包被抗原,FB1为竞争抗原,建立检测FB1的间接竞争化学发光ELISA方法,并对该方法进行了条件优化。该方法对FB1标品进行检测,得到回归方程为Y=0.602 5-0.370 7 X,相关系数R2为0.986 2,检测限为0.14ng/mL,线性关系良好的检测范围为0.14～33.3ng/mL,玉米样品加标回收率83.5%～102%。表明建立的化学发光ELISA法敏感性好、特异性高,能用于玉米中FB1毒素的检测。     

邻苯二甲酸二丁酯酶联免疫分析方法的建立及镇江地区水体污染调查研究

采用制备的邻苯二甲酸二丁酯多克隆抗体建立可检测环境水体中痕量邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的间接竞争酶联免疫(ELISA)分析方法,对各种参数进行优化后,在最优条件下本方法具有较高的灵敏度(检测限为66.6 ng/m L)、较宽的检测范围(70~1 600 ng/m L)、较好的准确度(回收率82.8%~104.0%)。利用此高通量分析方法对镇江部分河流中水样、底泥进行分析,结果发现镇江市区几处河流,DBP普遍检出,水样中DBP浓度为76.5~140.4 ng/m L,底泥中DBP浓度可达114.6~248.7 ng/g。     

产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法。【方法】将原核表达重组质粒pET-28a-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行Western blot鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA试验条件,建立其抗体间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察,并用其对521份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性,获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ELISA条件为:抗原最佳包被质量浓度为5.0μg/mL,阳/阴性血清最佳稀释度为1∶50,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 500,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃封闭1h,抗原抗体作用1h,TMB显色30min。间接ELISA的判定标准为OD450≥0.313为阳性,OD4500.313为阴性;建立的间接ELISA方法的特异性为96%,敏感性为98%;批内变异系数在3%~4%,批间变异系数在9%以下。利用间接ELISA检测方法对521份临床山羊血清样本的检测结果表明,抗体阳性率为72.5%。【结论】对产气荚膜梭菌β毒素进行了原核表达,成功建立了其抗体间接ELISA检测方法,为产气荚膜梭菌β毒素抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

高效液相色谱测定食品中的黄曲霉毒素

[目的]建立液相色谱对食品中的4种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2进行定性和定量分析的检测方法。[方法]试样经过甲醇+水提取,滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析柱净化,以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱,通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。[结果]试验表明,4种黄曲霉毒素在3.0~30.0 ng/ml和10.0~50.0 ng/ml质量浓度范围内线性关系良好,相关系数均不小于0.999;4种黄曲霉毒素的检出限均为0.25μg/kg。在3个不同的加标水平下,4种黄曲霉毒素的回收率在70%~99%,相对标准偏差为分别为1.7%~7.6%。[结论]该方法能有效检测出多种食品中4种黄曲霉毒素的残留量,且稳定性好,结果可靠。     

T2毒素人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

合成并鉴定T 2毒素人工抗原,通过动物免疫制备敏感性高、特异性好的鼠源T 2毒素多克隆抗血清。采用琥珀酸酐法将T 2毒素活化为T 2HS,T 2HS在碳二亚胺(EDC)作用下与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联,合成免疫抗原T 2 BSA和检测抗原T 2OVA,经鉴定后,分别按30、50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后1次免疫10d后,断尾采血,制备多抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定其敏感性和特异性。结果表明,免疫的6只小鼠效价均达到了1∶104以上,2号小鼠多抗血清的敏感性最好,其半数抑制质量浓度(IC50)为324ng/mL,且具有良好的特异性。成功合成了T 2毒素人工抗原,制备了多克隆抗体血清,为T 2毒素单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

基于核酸适配体检测饲料中黄曲霉毒素B1的方法

【目的】建立一种基于核酸适配体检测饲料中黄曲霉毒素B_1的方法,为饲料中黄曲霉毒素B_1的检测提供技术支撑。【方法】利用FAM荧光标记的核酸适配体与黄曲霉毒素B_1的特异性结合,而与偶联BHQ1的互补序列无法配对,导致荧光值变化而实现检测。【结果】在优化条件下,链亲和素浓度为100μg/mL,核酸适配体浓度为250nmol/L,互补序列浓度为500nmol/L,黄曲霉毒素B_1在0.01～10.0ng/mL范围具有较好的线性关系,最低检测限为0.01ng/mL;与黄曲霉毒素B_2、黄曲霉毒素G_1、黄曲霉毒素G_2、桔霉素和赭曲霉素A的交叉反应率均较低,饲料样品中添加黄曲霉毒素B_1的平均回收率为91.3%～105.0%。【结论】建立的方法快速、准确、灵敏,选择性好,可用于饲料中黄曲霉毒素B_1的分析检测。     

农产品中黄曲霉毒素的时间分辨荧光免疫层析快速检测技术研究

【目的】黄曲霉毒素严重污染农产品,威胁人畜生命健康,是政府重视、社会关注的一大焦点问题,因此亟需研究建立黄曲霉毒素高灵敏高快速检测方法。目前已研制出高特异性高灵敏度黄曲霉毒素单克隆抗体,本研究旨在应用该抗体,建立黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析快速检测技术,为农产品质量监管、风险评估提供技术支持。【方法】本研究通过将黄曲霉毒素抗体与乳胶铕进行偶联标记,利用自主研制的黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条进行黄曲霉毒素检测,通过检测线T信号值与质控线C信号值的比值和标准溶液浓度的自然对数值实现定量。针对花生、稻米、植物油等不同农产品,研究建立样品粉碎均质提取一体化技术。对铕标记时间分辨荧光免疫层析检测技术进行方法学考核,以花生、稻米、植物油等为例,进行实际样品检测,并与HPLC法进行结果比对。【结果】在花生、稻米、植物油等农产品实际样品检测中,本研究建立的时间分辨荧光免疫层析检测技术检测黄曲霉毒素B₁得到检测限均为0.3 μg·kg^-1,线性范围分别为0.8-25、0.8-15和0.8-30 μg·kg^-1。上述3种农产品对应的标准曲线的线性方程分别为y=0.238x+0.654（R²=0.992）、y=0.321x+0.811（R²=0.990）和y=0.146x+0.173（R ²=0.993）,标准偏差分别为0.024、0.039和0.021。该方法的批内准确度和精密度添加回收试验结果表明,添加回收率在81.0%-113.0%,变异系数在7.2%-14.2%;批间准确度和精密度试验结果显示,添加回收率在75.8%-114.9%,变异系数在7.7%-15.3%。说明该检测技术批内、批间均具有良好的准确度和精密度。该方法与HPLC法检测结果相比,相对误差小于10%,说明黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析技术与行业标准方法检测结果具有良好的一致性。【结论】时间分辨荧光免疫层析检测技术灵敏度高、线性范围宽,重复性和稳定性好,是一种适合中国国情的实用快速检测技术,具有广阔的应用前景。     

大型溞ChE和NAGase间接竞争和非竞争ELISA方法的比较

[目的]探索间接非竞争ELISA和间接竞争ELISA法测定大型溞ChE和NAGase的试验条件及方法灵敏度。[方法]分别采用间接竞争和间接非竞争ELISA方法测定大型溞ChE和NAGase。[结果]对于ChE,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为1.466μg/m L和1∶10 000,灵敏度为7.426 7 ng/m L;间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为5.277μg/m L和1∶8 000,灵敏度为0.163 4 ng/m L。对于NAGase,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为8.961μg/m L和1∶6 000,灵敏度为4.199 9 ng/m L;间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为6.450μg/m L和1∶4 000,灵敏度为0.250 8 ng/m L。[结论]无论是ChE还是NAGase,间接竞争ELISA在最适抗体浓度下的检测灵敏度均高于间接非竞争ELISA,加之其操作简便,间接竞争ELISA在生物和环境样品ChE和NAGase含量检测中值得推广应用。     

乌头碱抗血清制备与鉴定

通过活性酯法将小分子的乌头碱(ACO)偶联到牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)上,形成偶联物ACO-BSA、ACO-OVA。以ACO-BSA为免疫原,ACO-OVA为检测原,通过ELISA法检测ACO-BSA免疫鼠血清效价,间接竞争ELISA法检测抗体特异性、最低检测限。结果表明,免疫原和检测原均偶联成功,血清效价均大于12 800。间接竞争ELISA法检测结果表明,所获抗体对ACO特异性强,最低检出限为1 ng/m L,IC50值为30 ng/m L,检测范围为1~6μg/m L。     

噬菌体展示纳米抗体模拟黄曲霉毒素抗原的活性表征

【目的】笔者实验室前期免疫并构建噬菌体展示纳米抗体库,应用此抗体库筛选、制备可以用作黄曲霉毒素无毒替代抗原的纳米抗体。本研究旨在探明已筛选出的噬菌体展示纳米抗体Phage 2-5用作黄曲霉毒素替代抗原的活性,为后续纳米抗体的合成以及黄曲霉毒素绿色免疫分析方法的建立奠定基础。【方法】前期,笔者实验室对羊驼免疫黄曲霉毒素抗原（AFB1-BSA）,经过5次免疫后,取血,提取RNA,反转录为cDNA,并采用PCR技术对抗体可变区VHH区域进行扩增,与载体pComb3X偶联,构建噬菌体展示纳米抗体库;经过吸附-洗脱的淘选过程筛选出能够与黄曲霉毒素竞争结合抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11的噬菌体展示纳米抗体Phage 2-5。本研究通过将抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11固定在酶标板上,以噬菌体展示纳米抗体Phage2-5作为竞争抗原,与反应体系中的游离黄曲霉毒素竞争结合抗体,构建酶联免疫分析（ELISA）体系,检测游离黄曲霉毒素含量,并分别对该方法的灵敏度、交叉反应率、缓冲液和样品基质对反应体系的影响进行测定。【结果】采用棋盘法确定了抗体最佳包被浓度为1.25 mg·mL-1,噬菌体最佳使用浓度为5´1011 pfu/mL。在最优条件下建立基于噬菌体展示纳米抗体Phage2-5的ELISA法,对黄曲霉毒素B1的IC50值为0.054 ng·mL-1,对黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为38.6%、70.1%、14.5%、14.6%;反应最高耐受甲醇浓度为20%;当pH值为7.0时,反应灵敏度最高,升高或降低pH对反应灵敏度均有影响;盐离子浓度对反应灵敏度影响不大,反应体系在5´PBS的环境下仍能保持较高活性,但纯水溶液不利于反应的进行;因此,该反应的最佳反应缓冲液是pH值为7.0的0.01 mol·L-1 磷酸盐缓冲液（PBS）,花生、大米、玉米基质对反应体系无显著影响。【结论】噬菌体展示纳米抗体Phage2-5具备良好的模拟黄曲霉毒素抗原的生物活性,用作替代抗原建立的免疫分析方法灵敏度高、甲醇耐受能力强,并且样品基质效应不明显,具有进一步研制黄曲霉毒素模拟抗原的前景。