伏马菌素B1间接竞争ELISA检测方法的建立和应用

以人工合成的抗原OVA-FB1作为包被抗原,FB1(伏马菌素B1)为竞争抗原,两者与一定量的抗FB1单抗反应,建立检测FB1的间接竞争ELISA方法,对玉米样品进行初步检测应用。结果表明,间接竞争ELISA方法最佳抗原包被浓度为196 ng/ml,包被时间为4℃过夜,单抗最佳工作浓度为1∶4 000,酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 500,最佳的抗原抗体竞争反应时间和温度为4℃过夜作用。可测最适范围为10~1 000 ng/ml,回归方程为y=1.113-0.313x,相关系数R2为-0.990,灵敏度为90.88 ng/nl,最低检测限为7.83 ng/ml,批内和批间变异系数分别为3.24%和2.45%,平均添加回收率为94.32%。     

应用间接竞争ELISA检测山羊痘抗体方法的建立

[目的]为山羊痘疫苗接种山羊后产生的抗体效价检测和山羊痘的诊断奠定基础。[方法]采用Vero-E6传代细胞分离山羊痘病毒抗原,建立检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA方法。[结果]检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA的最佳工作条件：最佳抗原包被浓度为1μg/ml,兔抗高免血清最佳稀释度为1∶16 000,待检血清的工作浓度为1∶400,阳性血清的临界值为45.19%,阴性血清的临界值为38.89%。用该试验建立的ELISA方法检测3 000份接种山羊痘疫苗的山羊血清,阳性检出率为83.33%,琼脂扩散试验检出率为77.33%,竞争抑制ELISA方法较琼脂扩散试验方法敏感。[结论]该方法具有特异性高、快速、敏感等特点,适合检测山羊痘抗体。     

β2-受体激动剂类药物多残留间接竞争ELISA检测方法的建立

【目的】建立β_2-受体激动剂类药物多残留间接竞争ELISA检测方法,为动物食源性β_2-受体激动剂类药物残留的快速检测提供技术支持。【方法】以沙丁胺醇多克隆抗体为基础,优化间接竞争ELISA的检测条件,建立一种快速检测猪尿中沙丁胺醇、卡布特罗、西布特罗、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、克伦潘特、可尔特罗、吡布特罗、马喷特罗、比托特罗与妥布特罗等12种β_2-受体激动剂类药物的间接竞争ELISA检测方法。【结果】建立的β_2-受体激动剂类药物间接竞争ELISA检测方法的最佳反应条件为:37℃,抗原以1∶10 000倍包被1 h,抗体以1∶40 000稀释作用40 min,酶标抗体以1∶20 000稀释作用40 min。采用建立的间接竞争ELISA最佳反应条件对猪尿中的β_2-受体激动剂类药物残留进行检测,结果表明12种β_2-受体激动剂类药物在0.1～20μg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.952;检出限为0.15μg/L,定量限为0.5μg/L;在0.5与1.0μg/L的添加浓度下,回收率为68.4%～114.2%,批内、批间RSD分别为0.4%～10.1%和0.4%～12.5%。【结论】所建立的β_2-受体激动剂类药物残留ELISA检测方法操作简单、快速,灵敏度高,适用于猪尿中β_2-受体激动剂药物的筛选与检测。     

奶牛孕酮间接竞争ELISA检测方法的建立

[目的]为孕酮检测试剂盒的研制奠定基础。[方法]采用二环己基碳化二亚胺法制备检测抗原,建立了检测奶牛孕酮含量的间接竞争ELISA方法。[结果]检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA的最佳反应条件确定为:最佳包被浓度为100 ng/ml,碳酸盐缓冲液的包被效果较好,以4℃过夜+37℃2 h佳,最佳封闭液为2%山羊血清,酶标抗体的工作浓度为0.13μg/ml。建立的标准曲线方程为y=-1.844 4x-0.140 1(R2=0.981 7),检测范围为0~20 ng/ml,最低检测限为0.58 ng/ml。该标准曲线的批内变异系数和批间变异系数分别为2.22%和2.37%。[结论]该研究建立了定量检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA方法。     

仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】研究并建立大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法。【方法】首先用大豆抗原蛋白对仔猪进行致敏,然后采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及血清稀释倍数,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白11S、7S抗体的间接ELISA方法,确立待测血清判定标准,并对建立的ELISA方法进行重复性、准确性和敏感性检测。【结果】建立的ELISA方法的最佳反应条件为:11S抗原蛋白最适包被质量浓度为2.0μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间15min。7S抗原蛋白的最适包被质量浓度为2.5μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间25min。11S和7S抗原蛋白间接ELISA检测方法的批内、批间变异系数均小于10%,重复性较好,灵敏度较高。【结论】建立了仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法,该法具有很强的特异性和敏感性,可用于大豆抗原蛋白11S、7S过敏反应的临床诊断。     

延边黄牛气肿疽间接ELISA诊断方法的建立

[目的]检测延边黄牛气肿疽病原体,为牛气肿疽的检测提供科学方法和依据。[方法]采用气肿疽梭菌裂解菌体为抗原,建立检测该病原菌的酶联免疫吸附检测方法,确定其最适工作条件。[结果]气肿疽梭菌菌体裂解抗原最适包被浓度为50μg/m l;待检血清的最适稀释度为1∶200,酶标二抗的最适工作浓度为1∶2 000;对随机采集于延边地区的30份牛血清样品进行间接ELISA检测,阳性率为20%。[结论]建立的间接ELISA方法特异性和重复性好。     

玉米弯孢菌叶斑病菌ELISA检测方法的建立

利用玉米弯孢菌叶斑病病原菌菌丝蛋白作为抗原,制备了该病原菌菌丝蛋白的多克隆抗体,建立了检测玉米弯孢菌叶斑病菌的间接ELISA方法。结果表明,玉米弯孢菌抗血清的效价为1∶32 000;最佳抗原、抗体工作浓度分别为5μg/m l和1∶2 000;在最佳抗原抗体工作浓度下,理想包被液为碳酸盐缓冲液(pH值9.6),包被时间为4℃包被过夜;抗原抗体最适竞争反应时间为37℃下1 h;灵敏度为0.02μg/m l,此抗体可以与弯孢菌发生特异性反应,而与其他10种供试病原真菌的菌丝蛋白均呈阴性反应。     

两种鮰爱德华菌ELISA快速检测方法的建立与应用

为了对水产动物致病菌鮰爱德华菌进行早期、快速地检测,以鮰爱德华菌单克隆抗体5D11作为检测抗体,分别建立了间接ELISA和竞争ELISA两种快速检测鮰爱德华菌的方法,并用棋盘滴定法进行了条件的优化。结果显示,间接ELISA实验中采用37℃过夜这种包被方法能有效促进酶标板对细菌的吸附作用,单克隆抗体和二抗的最佳稀释倍数分别为1∶80和1∶1 000,病原菌的检测灵敏度为5×106 cells/mL,交叉反应实验证明该方法特异性强,并且可用于对鮰爱德华菌标准菌株及其分离株的快速检测;同时采用棋盘滴定法确定了竞争ELISA实验中包被抗原-抗体最佳工作组合为5×108~1∶80、抗体和竞争抗原比例为3∶7,并制作出了相关系数为0.990 1的标准曲线,该方法特异性强,最低检出限106 cells/mL,可在一定范围内对鮰爱德华菌进行定性和定量检测,弥补了间接ELISA的不足。     

KGF-2单克隆抗体间接ELISA筛选方法的建立

目的建立KGF-2单克隆抗体间接ELISA的筛选方法 ,制备KGF-2单克隆抗体.方法以KGF-2为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.通过棋盘滴定方法确定间接ELISA的抗原包被浓度及一抗、二抗最佳工作浓度;利用建立特异性好的间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞株.结果通过棋盘滴定最终确定了500μg/L的抗原包被浓度、1∶1 000的一抗血清稀释倍数及1∶2 000的二抗血清稀释倍数;筛选到两株可稳定分泌抗体、效价较高的杂交瘤细胞株.结论该研究建立了灵敏度高、特异性好的间接ELISA筛选体系,可用于KGF-2单克隆抗体的制备及检测.     

大型溞胆碱酯酶间接非竞争酶联免疫吸附定量分析法的建立

用达到电泳纯的大型溞(Daphniamagna)胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)免疫BALB/c小鼠,得到效价达1∶8000的鼠抗大型溞ChE多克隆抗血清;通过优化抗原抗体反应条件,建立定量分析大型溞ChE含量的间接非竞争酶联免疫吸附法(indirectandnon‐competitiveenzyme‐linkedimmunosorbentassay).结果表明:此方法检测灵敏度为24ng爛mL-1;经免疫交叉反应鉴定,所获抗血清与5、10μg爛mL-1标准蛋白质和其他生物如花翅摇蚊、尖额溞、斑马鱼(脑、脑除外的整体)、家蚕、意大利蜜蜂、赤子爱胜蚯蚓、非洲爪蟾(蝌蚪)等来源的ChE交叉反应率分别为:<0畅25%、<0畅25%、 2畅13%、 10畅19%、3畅88%、 3畅56%、 2畅81%、 3畅93%、 5畅00%和2畅75%,具较高的特异性.说明用本试验得到的抗血清建立的间接非竞争酶联免疫吸附法可用于大型溞体内ChE含量的测定,以利于在农药暴露环境下大型溞体内ChE活性的精确检测.     

间接酶联免疫吸附法测定大鲵凝集素

[目的]建立基于大鲵凝集素多克隆抗体酶联免疫定量分析的方法。[方法]以大鲵凝集素为抗原,免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,建立间接非竞争酶联免疫检测方法,并对该方法的精密度及准确度进行了测试。[结果]获得的抗血清效价为1∶16 000,多克隆抗体血清的最佳稀释度为1∶3 000,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗最佳稀释度为1∶30 000,抗原浓度在31.25~1 000.00 ng/m L范围内呈良好的线性关系,相关系数R~20.99,板内及板间变异系数范围分别为2.50%~9.88%和2.69%~11.59%,回收率为91.5%~109.5%。分布结果显示,大鲵凝集素在躯干部肌肉组织中的含量较高。[结论]成功建立了大鲵凝集素间接非竞争酶联免疫检测方法,该方法灵敏度高,重复性好,可用于实际检测大鲵肌肉组织中的凝集素含量。     

重组Ⅸ蛋白检测犬传染性肝炎病毒抗体间接ELISA方法的建立

[目的]建立用重组蛋白Ⅸ检测犬传染性肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。[方法]分别设置不同抗原包被浓度、包被条件、封闭液等,比较ELISA反应效果。[结果]最佳抗原包被浓度为5.0μg/ml;最佳包被条件为,37℃包被1 h、4℃过夜;最佳封闭液为5%BSA;HRP-羊抗犬IgG的最佳工作浓度为1∶1 600。[结论]建立了检测犬传染性肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。     

刚地弓形虫RH株SAG3蛋白抗体检测的ELISA方法建立

[目的]利用纯化的刚地弓形虫RH株表面蛋白SAG3的原核重组蛋白为基础,建立抗体间接ELISA检测方法。[方法]采用棋盘滴定法,确定间接ELISA的最佳条件。采用鼠抗新孢子虫阳性血清、鼠抗安氏隐孢子虫阳性血清、鼠抗柔嫩艾美尔球虫阳性血清、鼠抗蓝氏贾第虫阳性血清以及鼠抗微小隐孢子虫阳性血清和健康小鼠阴性血清作对照,检测血清之间是否有交叉反应。[结果]最佳包被条件为:抗原包被浓度0.25μg/孔,被检血清稀释度1∶400,酶标二抗稀释度1∶3 000,封闭剂5%脱脂奶粉的PBST溶液;血清之间没有交叉反应。该方法的灵敏度为1∶1 600。[结论]该方法灵敏度高,特异性较强,可重复性较好,可用于对弓形虫感染的检测及流行病学调查。     

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的酶联免疫检测

[目的]为细菌毒素的检测提供理论依据。[方法]以BALB/c小白鼠为免疫对象,以自制的高纯度金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)为免疫抗原,研究其抗体的产生过程和效价,并建立SEB的间接竞争ELISA检测方法。[结果]自制SEB纯度较高,能较好地刺激动物产生抗体。以自制SEB为免疫抗原注射BALB/c小白鼠,其最高效价为1∶100 000。SEB浓度在1~1 000 ng/ml范围内,竞争抑制率与SEB浓度的对数值呈显著线性关系。当SEB的浓度为5~500 ng/ml时,随样品中SEB浓度的增加,污染样品的回收率变异系数减小,检测准确度提高。[结论]对不同污染程度的牛奶样品,利用间接竞争ELISA法检测其SEB残留的灵敏度远远高于生化法。     

抗双酚A多克隆抗体的制备

[目的]制备可以识别双酚A（BPA）的多克隆抗体。[方法]通过双酚酸（DPA）与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）以及卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原DPA-BSA和包被抗原DPA-OVA,以DPA-BSA免疫新西兰大白兔获得抗血清,并采用间接竞争酶联免疫吸附（ELISA）检测方法对抗体进行鉴定。[结果]经紫外光谱分析,DPA-BSA和DPA-OVA制备成功。抗血清效价最高达到1∶256 000,50%抑制率（IC50）达17.2 ng/ml。[结论]该研究为建立双酚A的快速筛选方法奠定了基础。     

牛乳铁蛋白直接竞争ELISA检测法的建立

[目的]建立一种检测牛乳铁蛋白(LF)含量的竞争ELISA检测方法。[方法]制备鼠抗牛LF单克隆抗体,采用直接竞争ELISA测定酶标记物效价,建立牛LF的直接竞争ELISA检测方法。[结果]纯化后,制备的鼠抗牛LF单抗效价达1∶1 280 000,且鉴定为IgG1。该单抗对牛乳铁蛋白具有很强的特异性。制备酶标单抗的效价为1∶640 000。抗原包被物和酶标单抗的最适工作浓度分别为1.0μg/ml和1∶40 000。抗原用碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)包被先在4℃过夜、再37℃放置2 h的效果最好。采用2%牛血清白蛋白作为封闭剂的效果最好。在31.25~1 000 ng/ml浓度范围内,牛乳铁蛋白的logit(B/B0)与牛乳铁蛋白浓度的对数值呈显著的线性关系,其回归方程为y=-1.899 1x+5.043 3(R2=0.987 3)。[结论]该研究为研制用于奶牛乳腺炎诊断的牛LF检测试剂盒奠定基础。     

鹿血双抗体夹心间接ELISA检测方法的建立

通过制备兔抗鹿血和小鼠抗鹿血多克隆抗体,建立了以兔抗为包被抗体,鼠抗为检测抗体的鹿血双抗体夹心间接ELISA检测方法。采用方阵滴定法确定了抗原、抗体的最佳反应浓度,并对ELISA各反应条件进行优化。结果表明:兔抗最佳包被浓度为1∶8 000,鼠抗的最佳反应浓度为1∶2 000,最佳封闭时间为60 min。该方法对鹿血检测灵敏,可达3×10-4倍稀释度,且对马血、牛血、羊血、猪血的检测结果均为阴性,说明该方法特异性良好。