亚致死剂量二嗪农对锦鲫的毒性效应及鱼体富集研究

采用半静态法测定了二嗪农对锦鲫的急性毒性,并以AChE活性为毒性指标,研究了亚致死作用剂量(96h-LC50的1/5、1/10、1/20、1/40)下持续暴露30 d和在清水中恢复30 d时二嗪农对锦鲫的慢性毒性效应,以及锦鲫不同组织对二嗪农的富集作用,为评价二嗪农环境生态风险提供依据.结果表明:二嗪农对锦鲫的96h-LC50为11.04 mg/L,乙酰胆碱酯酶活性的抑制率随剂量的增加而增大,最高抑制率可达91%;酶活恢复过程缓慢,最高恢复率仅为21.6%;组织中的富集量大小依次为肝>肉,恢复30d后各组织仍有二嗪农残留且富集大小顺序保持不变.     

毒死蜱对锦鲫性腺的影响及其在鱼组织中的富集

采用半静态法,在测定毒死蜱对锦鲫急性毒性的基础上,分析了亚致死剂量(96 h-LC50的1/5、1/10、1/20、1/40)作用30 d,毒死蜱对锦鲫(Carassius auratus)的性腺指数(GSI)的影响,并考察了毒死蜱暴露过程和清水恢复过程中锦鲫不同组织对毒死蜱的富集作用,为评价毒死蜱环境生态风险提供依据.结果表明,毒死蜱对锦鲫的96 h-LC50为1.400 mg/L,0.280 mg/L的毒死蜱能够显著抑制雄性锦鲫性腺的发育,毒死蜱在其肌肉和肝脏中的富集量在处理后20 d左右达到累积和释放的动态平衡,组织中的富集量为肝脏>肌肉,清水恢复30 d各组织富集量顺序保持不变.     

基于双抗夹心的Cry1B毒素蛋白质TRFIA检测方法的建立与评价

为了建立检测Cry1B毒素蛋白质的双抗夹心时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法,利用稀土元素Eu3+作为示踪剂,以可溶性表达的抗Cry1B毒素蛋白质单链抗体(scFv)作为捕获抗体,以免疫兔血清获得的抗Cry1B毒素蛋白质多克隆抗体为检测抗体,建立检测Cry1B抗原的TRFIA技术,并对其进行方法学的综合评价。通过正交试验,获得的最佳单链抗体(Capture antibody)、多克隆抗体(Detection antibody)、Eu3+标记的二抗(Tracer antibody)浓度分别是2.500μg/ml、2.000μg/ml、1.000μg/ml。标准检测曲线灵敏度为0.170 ng/ml,线性测量范围为1.000～800.000 ng/ml。抗原类似物间无交叉反应。Cry1B毒蛋白质在大米中添加回收的批内变异系数为3.8%～6.6%、平均回收率为80.5%～84.8%,批间变异系数为2.2%～8.5%、平均回收率为84.1%～88.4%。表明本试验建立的双抗夹心Cry1B-TRFIA检测范围宽,特异性强,重复性和稳定性好。     

高表达粟酒裂殖酵母SpTrz2p对细胞周期的影响

[目的]测定粟酒裂殖酵母高表达的SpTrz2p对其细胞周期的影响。[方法]将粟酒裂殖酵母的trz2+克隆到pREP4x质粒上,构建带有SpTrz2的高表达载体,将构建成功的重组子转化至野生型粟酒裂殖酵母细胞中,利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。[结果]高表达SpTrz2p可导致酵母细胞形态和周期的改变,使大部分酵母细胞停留于G1期,这说明高表达SpTrz2p对细胞周期有明显影响。[结论]该研究结果表明高表达SpTrz2p给细胞造成的致死毒性是通过影响细胞周期实现的。     

粟酒裂殖酵母蛋白质细胞定位载体的构建

[目的]构建用于研究粟酒裂殖酵母蛋白质细胞定位的载体。[方法]将gfp＋和nmt1＋启动子基因克隆到pJK148质粒中,构建含有GFP的表达载体,并利用野生型trz1＋检测荧光表达效果。[结果]nmt1＋启动子与trz1＋的起始密码子相距45个碱基时,无荧光信号。当nmt1＋启动子与trz1＋的起始密码子相距6个碱基时,荧光信号很强。[结论]可以利用pYJ4研究粟酒裂殖酵母蛋白质的细胞定位。     

粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白全长和N端的原核表达与多克隆抗体制备

采用生物信息学方法分析粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的生物学特性,利用PCR方法扩增粟酒裂殖酵母yAS56菌株SpTrz2的全长和N-末端一半的编码基因,通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点将SpTrz2的全长和N-末端一半编码基因定向插入pET-28a(+)原核表达载体中,并转化大肠埃希菌BL21(DE3);经过IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE电泳切胶纯化法获得重组蛋白,以此为抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting检测抗体特异性。结果表明,SpTrz2是一个跨膜蛋白,含有3个跨膜结构域,具有多个B细胞抗原表位。SDS-PAGE电泳分析发现,粟酒裂殖酵母SpTrz2的全长和N-末端一半(SpTrz2和SpTrz2N)都以包涵体形式高效表达,其理论相对分子质量分别约为75.99 ku和44.77 ku。Western blotting检测显示,制备的兔抗SpTrz2和SpTrz2N多克隆抗体可以特异性识别天然的SpTrz2蛋白。本研究成功诱导表达、纯化重组蛋白SpTrz2和SpTrz2N,并制备了多克隆抗体,为SpTrz2蛋白的生物学功能相关研究奠定了基础。     

粟酒裂殖酵母tRNA前体3′末端加工酶Trz1p功能的研究

[目的]研究粟酒裂殖酵母tRNA前体3’末端加工酶Trzlp在体内的功能，为以后进一步探索Trzlp的功能奠定基础。[方法]构建Trz1’的表达载体pREP82x．trzl-5flag，通过醋酸锂转化法将pREP82x-trzl-5flag转入yYH1菌株和7k1‘的缺失菌株ySS0319中，并进行随机孢子分析。[结果]Trz1pC-端添加5FLAG仍能促进tRNA前体3’末端的加工成熟，但Trz1-5flag不能救活Trz1’的缺失菌株。[结论]粟酒裂殖酵母Trzlp具有tRNA前体3’末端加工功能。