牛流行热病毒糖蛋白基因的原核表达与抗原性鉴定

为探索可用来开发牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV)疫苗和诊断试剂的候选基因,本研究针对BEFV糖蛋白(G)基因设计了2对特异性引物,用PCR方法扩增基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和Nde Ⅰ双酶切后亚克隆到表达载体pET-30上,将鉴定正确的重组质粒(480-pET-30、1107-pET-30)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,培养阳性菌株D_{600 nm}值为0.6~1.0,37 ℃下用1.0 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,将其纯化之后进行SDS-PAGE和Western blotting免疫原性分析。同时,应用间接ELISA、动物免疫试验及交叉反应试验对目的蛋白进行分析。结果表明,首次发现的1 107 bp基因片段是分段表达的,具有很好的生物活性和特异性,更适合作为开发疫苗和诊断试剂的候选基因,为今后建立BEFV的血清学诊断方法及疫苗研发提供了理论基础。     

表达牛流行热病毒G基因的牛传染性鼻气管炎病毒转移载体的构建

本试验将克隆到 p BLG中的牛流行热病毒 (BEFV)糖蛋白 G基因亚克隆到含有 CMV启动子和 Poly(A)信号尾的 p CR3- Uni载体上 ,获得 p CR3- G重组体 ,酶切后将含有 CMV、G基因和 Poly(A)的目的片段 (约 3.6 kb)插入通用转移载体 pd TK- CMB中 ,获得 pd TK- CMB- G重组体 ;再将含 SV4 0启动子的 L ac Z报告基因也亚克隆到该载体中获得表达 BEFV G基因的pd TK- L ac Z- G转移载体 ,为开发 BEFV/IBRV二联基因工程疫苗奠定了基础     

猪瘟病毒对ST细胞NF-κB信号通路炎性因子表达量的影响

探讨猪瘟病毒(CSFV)感染猪睾丸上皮细胞系(ST)对核因子-κB(NF-κB)信号通路相关炎性因子的表达。分别收集CSFV感染4、8、12、16、24、48 h的ST细胞,建立正常对照组和CSFV感染各试验组。荧光定量PCR(qPCR)法检测NF-кB通路相关炎性因子CHUK、IKBKB、NFKBIA、RelA基因mRNA表达量的变化,Western blot检测p65蛋白在核中的表达。NFKBIA、IKBKB基因的转录水平差异显著(P0.05);RelA基因的表达差异不显著(P0.05);CHUK基因在ST细胞感染CSFV后,转录水平差异显著(P0.05),Western blot试验显示,p65入核。CSFV感染ST细胞后,NF-κB的经典信号通路和非经典信号通路的均被激活,初步探索了机体感染CSFV对NF-κB通路上、下游的影响,为猪瘟的有效防控提供理论依据。     

基于RNA-Seq技术分析非致病细胞病变BVDV感染牛单核细胞对NF-κB信号通路的影响

非致细胞病变(NCP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV)可引起持续的潜伏感染和免疫抑制,但是具体的感染机制尚不清楚。采用RNA测序(RNA-seq)技术,以NCP BVDV感染牛单核细胞2h和24h的细胞为样本分别提取总RNA,并采用HiSeqTM2500高通量测序技术进行转录组测序,对获得的有效序列进行功能注释及相关生物信息学分析。结果显示,在感染2h后,筛选出差异表达基因9959个,其中4968基因表达上调;在感染24h后,筛选出差异表达基因7977个,其中4184的基因表达上调;进一步分析NF-κB信号通路的变化,结果显示,在感染后2h,与免疫反应或抗病毒活性相关的基因表达显著增加,到感染24h表达水平显著下降。变化显著的基因均与炎症、免疫、自噬和凋亡密切相关。研究建立的牛外周血单核细胞感染BVDV后差异表达基因数据库,丰富了BVDV与宿主之间的相互关系,为BVDV持续感染机制的研究奠定基础。     

牛流行热病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

牛流行热(BEF)是由牛流行热病毒(BEFV)引起的一种急性、热性传染病,是一种牛非接触性的虫媒病毒性疾病。该病发生于夏末秋初,给养殖业造成了重大损失。目前,国内外并没有针对该病的血清学检测方法。本研究针对BEFV的免疫保护基因——G基因(包含有G1基因的片段),设计引物,构建了表达载体,表达了该基因,利用此蛋白作为抗原,建立了牛流行热病毒抗体间接ELISA检测方法。本方法为牛流行热病毒的检测提供了有效的检测手段,也为我国制定牛流行热病毒的防控战略提供一定的理论依据。     

牛流行热病毒生物学和理化特性试验

一些学者用牛流行热含毒血液和含毒血液感染适应 BHK_(21)细胞的病毒液对牛以外的动物进行感染试验的结果表明,牛流行热病毒(BEFV)不能使马、绵羊、山羊、犬、家兔、豚鼠、大鼠、小鼠和鸡胚感染发病。1967年 Van der westhuizen 用1～3日龄乳鼠脑内接种可使之发病并分离到病毒。1969年,Tanaka Y 等对 BEFV 的理化特性进行了比较系统的试验。翟中和等     

基于转录组数据分析环形泰勒虫对诱导宿主细胞转化相关基因的影响

本试验主要通过研究布帕伐醌(BW720)处理前后,环形泰勒虫转化牛单核细胞(TaNM Ⅰ)转录组数据的变化情况,为进一步研究环形泰勒虫诱导宿主细胞转化的分子机制奠定基础。以环形泰勒虫感染的牛单核细胞为试验材料,设置对照组(二甲基亚砜,DMSO)和试验组(BW720),利用Illumina HiSeq4000测序平台进行高通量测序,将测序得到的原始数据(Raw reads)与GenBank和Rfam数据库进行比对过滤,通过质控获得最终数据(Clean read)。利用Venn分析软件筛选出DMSO组和BW720组中差异表达明显的基因,进行功能注释(GO)以及信号通路(KEGG)分析。随机选择10个基因,利用荧光定量PCR (qPCR)检测基因在不同处理条件下细胞中的表达量。在验证测序结果的准确性后,选出差异表达明显的基因,分析其在TaNM Ⅰ细胞的凋亡、增殖等信号通路方面的作用。结果显示：BW720组和DMSO组中分别得到6 854 019 704和6 627 265 854条Raw reads,过滤、质控后分别得到22 925 606和22 171 427条Clean reads。BW720组和DMSO组中筛选出差异表达明显的基因共计4 054个(P＜0.05),其中,2 146个基因显著上调,1 908个基因显著下调;进一步筛选出共同差异表达的基因367个,其中,显著上调的196个,显著下调的171个。同时,qPCR验证随机选择10个基因的表达趋势与转录组测序结果一致,表明测序结果可靠。然后对差异表达基因进行GO功能注释,筛选到与细胞增殖相关的20个生物学过程、15个细胞组分以及11个分子功能条目。KEGG富集分析结果显示,在Top20的信号通路中筛选出与环形泰勒虫转化细胞有关的一些信号通路,如：癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等。对这些信号通路进一步分析发现：PI3KR3、FOXO1、IL23A、FZD3、AKT、MMP9等基因在环形泰勒虫转化细胞的研究中也有相关文献的报道。本研究表明,在TaNM Ⅰ细胞中DAPK1、FZD3、FOXO3、PI3KR3等可能在感染细胞无限增殖的过程中发挥作用,为后续研究TaNM Ⅰ细胞无限增殖机制奠定了基础。     

牛流行热病毒山东流行株G基因的克隆及序列分析

为了解牛流行热病毒(BEFV)山东流行株G基因的特点,从临床病料中获得山东流行株牛流行热病毒的G基因,并对其进行序列测定和分析。参考GenBank中牛流行热病毒的G基因序列,设计并合成一对特异性扩增G基因引物进行PCR,扩增目的片段,并克隆于pEASY-T3载体上,筛选阳性重组质粒进行序列测定,用MEGA软件、NJ法构建进化树。结果显示,该流行毒株G基因与GenBank中其他BEFV株G基因的核苷酸推导氨基酸的同源性均大于96%;遗传进化关系分析结果表明,BEFV山东流行株与中国台湾流行株具有较高同源性和较近的亲缘关系。     

猪A型塞内卡病毒感染诱导猪肾细胞(PK-15)长链非编码RNA差异表达谱的分析

为研究猪A型塞内卡病毒(SVA)感染猪肾细胞(PK-15)后对于PK-15 lncRNA表达谱的影响,本研究进行了高通量测序以检测SVA感染诱导PK-15产生的差异表达lncRNA。结果显示,在SVA感染后24 h,共诱导1043个lncRNA差异表达,其中已知的lncRNA 420个,未知的lncRNA 623个。GO富集和KEGG通路分析显示,lncRNA靶基因富集于p53信号通路、RIG-I样受体信号通路、MAPK信号通路、IgA生成的肠道免疫网络通路等。根据高通量测序结果选择了8个差异表达的lncRNA采用荧光定量PCR验证,验证结果与高通量测序结果一致。本研究初步表明lncRNA参与了SVA对PK-15细胞的感染过程,为SVA的分子机制研究提供了新的方向。     

禽白血病病毒亚群重组囊膜蛋白基因的表达效果

用ELISA法测定了重组杆状病毒rBac-4817env感染的Sf9细胞中重组囊膜蛋白基因的表达效果。用特异性抗禽白血病病毒J型群（ALV-J）单克隆抗体JE9荧光染色证明了重组病毒能够在感染的Sf9细胞中表达ALV-J的env基因；糖基化抑制试验的结果表明，Sf9细胞表达的env基因产物是一种糖基化蛋白。不同量的重组病毒感染细胞与基因产物的表达产量无正相关，然而当每个细胞感染的病毒量2-800个时，表达产量相对较好。表达产物以感染后72-96h较高，并随着感染时间的延长，分泌到细胞外的重组基因产物有所增加，但在120h后，表达产物分解增加。研究结果对今后获取大量的基因的产物，并对其特性进一步研究奠定了基础。     

miRNA合成途径研究进展

miRNA是一类约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA,通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,利用RNAi沉默机制调控基因的转录后表达。它存在于动物、植物、病毒及许多微生物中,且其表达具有严格的时空属性,研究发现miRNA与组织细胞的生长发育和凋亡、癌症等进程相关。miRNA经典的生物合成过程包括微处理复合物的加工、核输出和Dicer酶处理,最后成熟的miRNA与AGO蛋白形成miRISC复合物。此外还存在其他的合成通路如mirtron通路、tRNA通路及内源性siRNA通路。本综述阐述了miRNA生物合成途径的基本原理及其研究进展,为miRNA的研究和应用提供参考。     

Distinct spatial activation of intrinsic and extrinsic apoptosis pathways in natural scrapie: association with prion-related lesions

Neurodegeneration and gliosis are the main neuropathological features of prion diseases. However, the molecular mechanisms involved in these processes remain unclear. Several studies have demonstrated changes in the expression of apoptotic factors and inflammatory cytokines in animals with experimental infection. Here we present the expression profiles of 15 genes implicated in the intrinsic and extrinsic apoptotic pathways in the central nervous systems of sheep naturally infected with scrapie. Expression changes obtained by real-time RT-PCR were also compared with the extent of classical scrapie lesions, such as prion deposition, neuronal vacuolisation, spongiosis, and astrogliosis as well as with the activation of caspase-3, using a stepwise regression. The results suggest that the factors assessed participate in apoptotic or inflammatory functions, depending on the affected area. The mitochondrial apoptosis pathway was associated with prion deposition in the prefrontal cortex (the less affected area), and with activation of caspase-3-mediated cell death via over-expression of BAK. In addition to its known association with astroglial activation, the extrinsic apoptosis pathway was also related to cell death and neuronal vacuolisation.     

昆虫抗菌肽基因表达调控机理

昆虫先天免疫应答主要通过模式识别受体识别入侵微生物,激活Toll和Imd信号途径,通过NF-κB样转录因子调控抗微生物肽基因的表达,合成高效广谱的抗微生物多肽,杀灭外源微生物.本文以果蝇的两个信号途径为例,通过与哺乳动物的TLR (Toll-like receptor)和TNFR (tumour-necrosis factor receptor)信号途径的比较,我们综述了昆虫免疫应答的激活机理的新近研究成果,并讨论了Toll和Imd信号途径的进化关系和昆虫模式识别受体的功能分类.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ调控机体炎症信号通路的研究进展

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferators-activated Receptorγ,PPARγ)是调控炎症反应的关键物质之一,其通过减弱核因子Kappa B(Nuclear Factor-kappa B,NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalKinase,JNK)活性,降低炎症因子含量从而缓解炎症反应,另一方面PPARγ与腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)互相抑制,共同维持动物正常机能。本文综述了PPARγ对动物炎症通路的调控作用,为其进一步研究和应用提供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征感染与细胞凋亡的研究进展

细胞凋亡是指在一定的生理或病理情况下,机体为维护内环境的稳定,通过基因调控,激活内源性核酸内切酶,发生细胞自动消亡的过程。研究猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）感染与细胞凋亡的关系及凋亡的可能机制将有助于人们认识PRRSV感染性的发生、发展及转归机制,现综述国内外近年来对PRRSV诱导细胞凋亡的相关研究进展,为进一步阐明PRRSV的致病机制和该病的防治提供一些新的思路。     

Fas/FasL通路对镉激活PC12细胞MAPK通路的影响

旨在研究Fas/FasL通路对镉激活PC12细胞MAPK通路的影响,用10 μmol L^-1醋酸镉（CdAc₂）分别处理插入非特异性序列PC12细胞与Fas基因沉默PC12细胞12 h;用10 μmol·L^-1CdAc₂与40 μmol·L^-1 Z-IETD-FMK （caspase-8特异性抑制剂）单独或联合处理PC12细胞12 h。通过Western blot检测Fas/FasL通路相关蛋白Fas、FasL、Fas相关死亡域蛋白（FADD）、Cleaved caspase-8、死亡结构域相关蛋白（Daxx）、凋亡信号调节激酶1（ASK1）的表达与MAPK通路相关蛋白ERK1/2、JNK1/2、p-ERK1/2、p-JNK1/2的表达;Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,Fas shRNA慢病毒极显著抑制镉引起的PC12细胞Fas/FasL通路相关蛋白表达量和凋亡率的升高（P<0.01）,缓解镉引起的PC12细胞凋亡形态学变化;Fas shRNA与Z-IETD-FMK均能够极显著抑制镉引起的PC12细胞MAPK通路相关蛋白ERK1/2与JNK1/2磷酸化水平升高（P<0.01）。综上表明,Fas/FasL通路调控MAPK通路参与镉致PC12细胞凋亡。     

不同温度下AOX和COX途径对苜蓿种子萌发和幼根生长的影响

为了研究不同温度下交替氧化酶(Alternative oxidase,AOX)和细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)呼吸途径在紫花苜蓿(Medicago sativa L.)种子萌发过程中的作用,本研究以'新牧4号'和'甘农5号'紫花苜蓿为试验材料,采用呼吸电子传递链专一性抑制剂水杨基氧肟酸(...     

沙门菌通过NF-κB/β-catenin信号通路引致IPEC-J2损伤的分子机制

为研究沙门菌引致IPEC-J2损伤的分子机制,试验用沙门菌刺激IPEC-J2,在特定时间收集细胞及其培养上清液,采用荧光定量PCR或ELISA检测细胞紧密连接蛋白、炎症反应相关蛋白和细胞增殖相关蛋白的表达以及乳酸脱氢酶（LDH）含量,以确定该沙门菌能够引起IPEC-J2损伤,并进一步采用NF-κB抑制剂和小干扰RNA预处理IPEC-J2,分析了NF-κB/β-catenin信号通路在沙门菌引起IPEC-J2损伤中的调控作用。结果显示,与对照组相比,沙门菌感染组紧密连接蛋白ZO-1和Occludin mRNA表达量在感染后6和24 h呈极显著下降（P<0.01）;促炎性细胞因子TNF-α和IL-8的生成量以及LDH释放量在感染后6、12和24 h呈极显著上升（P<0.01）,NF-κB p65的mRNA表达在感染后1、3和6 h也呈极显著上升（P<0.01）;细胞增殖蛋白cyclin D1和c-Myc的mRNA表达在感染后6、12和24 h呈显著下降（P<0.05）,其转录调控因子β-catenin的mRNA表达在感染后24 h呈极显著下降（P<0.01）。与沙门菌感染组相比,抑制剂+沙门菌感染组ZO-1和Occludin的mRNA表达量在12和18 h呈极显著增高（P<0.01）,而NF-κB p65、TNF-α和IL-8的表达以及LDH释放量在各时间点均呈极显著降低（P<0.01）;siRNA-β-catenin+沙门菌处理组的β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达量在各时间点均呈极显著降低（P<0.01）,LDH释放量在6和12 h均呈极显著增加（P<0.01）,但在18 h增加不显著（P>0.05）。本试验结果表明,沙门菌激活了NF-κB信号通路,促进了促炎性细胞因子的生成,加重了细胞损伤;同时,沙门菌抑制了β-catenin信号通路,降低了细胞增殖蛋白和紧密连接蛋白的表达,影响了细胞修复,从而出现细胞损伤与细胞修复之间的失调,最终呈现出细胞损伤。本试验从NF-κB/β-catenin信号通路的角度揭示了沙门菌引致IPEC-J2损伤的分子机制。     

巨噬细胞极化形成的影响因素研究进展

巨噬细胞是生物体中宿主防御的重要调节者。为了满足机体不同的需要,巨噬细胞可以在不同刺激因子作用下转化为具有不同功能表型的状态,这个过程称为极化。不同影响因素下的静息巨噬细胞(M0)可极化形成不同的表型,促炎表型(M1)和抗炎表型(M2)。极化后的巨噬细胞也可通过逆转它们的表型进一步重新编程。巨噬细胞极化和重编程在维持免疫系统的稳定状态中发挥重要作用,并参与许多疾病的发生发展过程。论文对巨噬细胞极化形成的影响因素进行了论述提供参考。