A型塞内卡病毒感染PK-15细胞环状RNA表达谱分析

【目的】分析A型塞内卡病毒（Seneca virus A,SVA）感染猪肾上皮细胞（PK-15）后环状RNA （circular RNA,circRNA）表达谱的变化,探究circRNAs在SVA感染过程中发挥的潜在调控作用。【方法】本研究基于Illumina HiSeq 2000平台对SVA感染及对照PK-15细胞circRNAs转录组进行测序,并对差异表达circRNAs的来源基因进行GO功能及KEGG通路富集分析,通过实时荧光定量PCR对新发现的circRNAs进行表达水平鉴定。【结果】转录组测序结果显示,SVA感染组、PK-15细胞对照组中共有432种circRNAs被发现。在SVA感染PK-15细胞中,87种circRNAs表达水平相对对照组PK-15细胞显著上调,74种circRNAs表达水平显著下调。对差异表达circRNAs的来源基因进行GO功能注释分析表明,SVA感染组差异表达circRNAs来源基因主要富集于核仁、细胞器膜和细胞大分子代谢、发育等生理过程。KEGG通路富集结果显示,SVA感染组差异表达circRNAs来源基因主要富集于胞吞过程、cAMP信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路。对6种新发现的显著差异表达的circRNAs进行实时荧光定量PCR验证,结果显示,其表达水平与高通量测序结果趋势一致。【结论】本研究首次对SVA感染PK-15细胞的circRNAs表达谱进行差异分析,发现差异表达的circRNAs广泛参与动物机体大分子代谢、胞吞及细胞增殖、黏附、抗病毒过程,为进一步探究circRNAs在SVA感染过程中的分子机制提供了理论依据。     

产肠毒素大肠杆菌F41感染猪小肠上皮细胞初期lncRNA的表达谱分析

本研究旨在分析产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）后，在感染初期细胞内长链非编码RNA （long non coding RNA，lncRNA）的表达谱变化，探究lncRNA在ETEC感染初期所起到的调控作用。使用ETEC F41感染IPEC-J2，在感染前和感染初期（感染后4 h）收集细胞，通过Illumina Hiseq Xten平台进行高通量测序，共发现lncRNA 9 975条。感染初期与感染前相比，共发现100条差异表达lncRNA，其中40条表达上调，60条表达下调。通过miRanda-3.3a和psRobot_v1.2软件共同预测差异表达lncRNA的靶基因，并对差异表达lncRNA的靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。结果显示，感染初期差异表达lncRNA的靶基因显著富集于细胞核、核仁、代谢过程调控及发育过程等GO功能条目中。KEGG分析表明，感染初期差异表达lncRNA的靶基因主要富集在PI3K-Akt信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、黏附斑及细胞周期等信号通路。利用实时荧光定量PCR随机验证了5条差异表达lncRNA，结果与测序分析中表达变化趋势一致。本研究对ETEC感染IPEC-J2细胞初期的lncRNA表达谱进行了差异分析，为深入探究lncRNA在ETEC感染初期中的作用机制提供了参考依据。     

猪戊型肝炎病毒ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢的lncRNA-mRNA调控网络的鉴定

为初步鉴定并挖掘出猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢信号通路的lncRNA-mRNA调控网络,本试验通过构建腺病毒过表达载体,制备高滴度过表达腺病毒,介导猪 HEV-ORF3在HepG2细胞中实现过表达。Western blotting检测ORF3蛋白过表达成功后,运用lncRNA高通量组学测序,筛选出差异表达的lncRNA并进行靶向差异基因预测,对lncRNA靶向差异基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,初步鉴定出与核黄素代谢信号通路相关的lncRNA-mRNA调控网络。Western blotting结果显示,在约为12 ku处出现目的条带,说明成功实现腺病毒介导猪HEV-ORF3在HepG2细胞中过表达。lncRNA高通量组学测序结果显示,共发现102个显著差异表达lncRNAs表达量上调,80个显著差异表达lncRNAs表达量下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,初步挖掘出lncRNA(MSTRG.13995.2)和lncRNA(MSTRG.1960.1)可能是与核黄素代谢信号通路相关的显著差异表达lncRNA,分别通过顺式调控其靶向基因APC-5和FLAD1来影响核黄素代谢信号通路。本试验初步鉴定出lncRNA(MSTRG.13995.2)-APC5和lncRNA(MSTRG.1960.1)-FLAD1可能是影响HepG2细胞核黄素代谢信号通路的lncRNA-mRNA调控网络。     

非洲猪瘟病毒感染后猪外周血淋巴细胞Toll样受体信号通路的lncRNA-mRNA分析

【目的】丰富非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染后猪外周血淋巴细胞长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）表达谱,并进一步挖掘影响Toll样受体信号通路的调控网络。【方法】试验动物感染ASFV,于第7天采集外周血并分离得到外周血淋巴细胞,运用Illumina高通量组学测序对外周血淋巴细胞中lncRNA进行测序,原始数据经处理后筛选获得差异表达的lncRNA,并进行靶基因预测,利用生物信息学方法对靶基因进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,初步绘制与Toll样受体信号通路相关的lncRNA-mRNA调控网络,并对lncRNA-ENSSSCG00000041959在内的4个lncRNAs进行实时荧光定量RT-PCR验证。【结果】共筛选到73个差异表达的lncRNAs,其中上调表达lncRNAs 38个,下调表达lncRNAs 35个。GO功能分析结果显示,靶基因显著富集在调节免疫系统过程、防御反应、生物刺激、病毒反应和先天性免疫;KEGG信号通路富集分析显示,大部分靶基因与细胞循环、疾病及免疫应答有关,其中免疫相关信号通路有Toll样受体信号通路、TNF信号通路、产生IgA的肠道免疫网络等。进一步挖掘出lncRNA-ENSSSCG00000041959-RIPK1和lncRNA-ENSSSCG00000041959-IRAK1可能是影响Toll样受体信号通路的重要调控网络,实时荧光定量RT-PCR与测序结果一致。【结论】本研究初步鉴定出lncRNA-ENSSSCG00000041959-RIPK1和lncRNA-ENSSSCG00000041959-IRAK1可能是影响Toll样受体信号通路的lncRNA-mRNA调控网络,为进一步探索lncRNA调控ASFV感染机体免疫反应奠定了理论基础。     

S VA及α-干扰素对P K-15细胞microRNA转录谱影响的分析

为探究猪塞内卡病毒A(SVA)感染、干扰素(IFN-α)处理对猪肾细胞(PK-15)微RNA(microRNA,miRNA)转录谱的影响，本研究分别构建SVA感染的PK-15(PK-15/SVA)、IFN-α处理的PK-15 (PK-15/IFN),SVA感染再经IFN-α处理的PK-15细胞(PK-15/SVA/IFN)，通过荧光定量PCR(qPCR)分别检测各组细胞中SVA VP1及IFN-αm RNA的转录水平。结果显示，与PK-15相比，PK-15/SVA及PK-15/SVA/IFN细胞中SVA VP1基因的转录水平极显著升高(P<0.001),PK-15/SVA/IFN中IFN-α的转录水平显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01)。通过转录组测序技术(RNA-Seq)分析各组细胞mi RNA的转录谱，采用Spss软件统计各组细胞中转录差异miRNA的数量；利用基于负二项分布的DESeq2筛选各组细胞中转录显著差异mi RNA；采用miRanda、PITA和RNAhybrid 3个软件预测各组细胞转录显著差异miRNA的靶基因，通过miREvo和mird...     

BHV-1感染MDBK细胞lncRNA表达谱系及lncRNA与mRNA的关联性分析

为探究牛疱疹病毒1型(BHV-1)感染MDBK细胞的长链非编码RNA(lncRNA)表达谱系变化及lncRNA与m RNA的关联性,本研究将BHV-1感染MDBK细胞,以未感染BHV-1的MDBK细胞作为对照,于感染后采用Illumina HiSeqTM4000测序,测序数据基于stringtie进行转录本重构,得到7 935个lncRNA转录本,再用CPC和CNCI两个软件进行新转录本编码能力的预测,获得681个新产生的lncRNA转录本。利用DESeq2软件对差异表达的lncRNA进行分析,结果显示,实验组共获得839个差异表达的lncRNA转录本,其中表达上调转录本508个,表达下调转录本331个。利用RNA plex软件对反义lncRNA与mRNA进行关联性分析,得到lncRNAmRNA相互作用的靶基因对1 227个,其中差异表达的lncRNA-mRNA相互作用靶基因对42个;顺式作用lncRNA与m RNA关联分析,获得lncRNA-mRNA靶基因对3 793个,差异表达的lncRNA-mRNA靶基因对149个;反式作用lncRNA与mRNA关联分析,获得lncRNA-mRNA靶基因对268 409个。通过基因本体论(GO)注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析进一步对与lncRNA关联mRNA的功能和途径进行分析,结果显示,关联的mRNA在细胞进程、单组织代谢过程、代谢过程及生物学调节等过程显著富集。随机选取10个差异表达的lncRNA,利用qRT-PCR方法进行验证,结果显示,其表达变化趋势与高通量测序数据趋势一致。本研究为进一步研究lncRNA在病毒感染中的作用奠定了基础,同时为进一步阐述BHV-1的发病机制、致病机理提供参考。     

猪卵母细胞GV/MⅡ期mRNA/lncRNA差异表达的研究

为解决体外成熟的猪卵母细胞受精后形成原核率低、多精入卵率高及体外成熟的卵母细胞囊胚率低等问题,本实验以猪卵母细胞为材料,采用转录组学的方法探讨卵母细胞成熟过程中mRNA/lncRNA的表达差异,筛选出影响猪卵母细胞成熟的关键mRNA/lncRNA。结果表明:本研究构建了2个时期的RNA文库,2组文库一共检测到已知的mRNA 1753030个,其中共表达mRNA16469个,2486个mRNA差异显著,其中上调基因752个,下调基因1734个;此次转录组测序共鉴定出lncRNA 22811个,2个时期差异表达已知lncRNA 15个,通过随机挑选10个测序所得到的mRNA转录本和12个lncRNA转录本进行QRT-PCR验证,基本与高通量测序保持一致,说明此次转录组测序结果符合要求,数据准确可靠,可以用于后续分析研究。     

山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞的miRNA表达谱变化分析

本研究旨在分析山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞和正常MDBK细胞差异表达的miRNA,以探索miRNA在CPIV3感染过程中的作用及其调控机制。将CPIV3感染MDBK细胞,利用高通量测序技术检测分析MDBK细胞中miRNA表达谱,并筛选差异表达的miRNA。对靶基因进行GO注释和KEGG富集。结果显示,有37个miRNA显著差异表达(P0.001),其中18个miRNA在病毒感染中上调,19个miRNA在病毒感染中下调。经RT-qPCR方法验证5个差异表达的候选miRNA,结果与高通量测序分析有很好的一致性。进一步GO功能注释表明:差异表达的miRNA靶基因生物学功能相对集中在免疫调节、细胞生物调控及细胞新陈代谢等生物过程。这些靶基因参与多种细胞的信号通路,包括细胞黏附分子、B细胞受体信号通路、MAPK信号通路、代谢通路、黏合斑、钙离子信号通路和趋化因子信号通路等。本研究为进一步探讨CPIV3致病机制奠定了基础。     

蛋鸡繁殖性能相关长链非编码RNA的筛选与鉴定

该研究通过对比蛋鸡不同生长发育阶段卵巢组织,筛选鉴定与蛋鸡繁殖性能相关的长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。通过提取20周龄(n=3)、30周龄(n=3)京红蛋鸡卵巢组织总RNA构建测序文库,利用RNA-seq技术及生物信息学分析方法鉴定差异表达lncRNA并进行qRT-PCR验证及功能富集分析。在不同周龄蛋鸡卵巢组织中共筛选鉴定到1 283个lncRNA表达,其中10个存在差异表达,qRT-PCR验证了测序结果。差异表达lncRNA显著富集到190条GO条目及5条KEGG通路中。研究结果表明lncRNA参与蛋鸡繁殖性能调控相关的生物学过程、细胞组分、分子功能以及多种信号通路。     

发情周期不同阶段绵羊卵巢lncRNA的鉴定和功能分析

旨在分析不同繁殖周期绵羊卵巢组织中长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,了解lncRNA表达及其调控机理,为绵羊繁育研究提供理论依据。本研究以湖羊为研究对象,选取年龄在1.5～2.5岁的黄体期和卵泡期母羊各3只,通过高通量测序筛选出卵巢组织中的lncRNA,运用生物信息学分析对差异表达的lncRNA进行靶基因预测,通过GO和KEGG富集分析找出与绵羊繁殖相关的通路。结果显示,本研究共获得1 379个差异表达的lncRNAs,其中1 158个表达上调,221个表达下调。GO和KEGG富集分析表明,差异表达的lncRNAs及其靶基因主要参与卵泡发育、排卵周期过程、钙离子信号通路、卵母细胞减数分裂、催产素信号通路、MAPK信号通路、甲状腺激素合成通路、雌激素信号通路。关键的lncRNAs可能通过调控参与这些信号通路和生物学过程的相关基因来调控生殖。其中,LNC_011239、LNC_012847、LNC_003902、LNC_003906、LNC_003907等靶向的MAPK1、ADCY1、ADCY5、PPP3CA和CDC23可能发挥关键的调控作用。qRT-PCR验证证明,随机选取的5个差异lncRNAs定量结果与测序结果基本一致。本研究利用RNA-Seq技术筛选出黄体期和卵泡期卵巢组织中的lncRNAs,并进行差异分析,为揭示绵羊繁殖能力的分子机制提供依据。     

PK-15细胞的TPL2基因敲除有利于口蹄疫病毒和塞内卡病毒复制

旨在构建TPL2（MAP3K8/COT）基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2^-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒（FMDV）和塞内卡病毒（SVA）复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一步提升FMDV和SVA产量指明方向。筛选2条针对TPL2基因的单向导RNA（sg RNA）,合成sg RNA并将其插入到含有GFP标签的慢病毒表达载体,构建sg RNA/Cas9慢病毒表达质粒,包装慢病毒并感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞。通过测序确认细胞系中TPL2的DNA序列,通过蛋白质印迹（Western blot）方法检测细胞系中TPL2表达情况。使用FMDV和SVA感染构建好的细胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID₅₀评估FMDV和SVA在PK-15-TPL2^-/-细胞中的复制水平,在此基础上通过测定干扰素（IFN）和IFN刺激基因（ISG）的mRNA表达水平,研究了FMDV或SVA感染的PK-15-TPL2^-/-细胞中干扰素途径的激活状态。TPL2基因敲除PK-15细胞系中TPL2基因发生了碱基插入突变和碱基缺失突变,构建的细胞系中均未检测到TPL2蛋白质表达。测定并比较了FMDV和SVA感染的PK-15和PK-15-TPL2^-/-细胞中病毒含量,表明TPL2基因敲除显著促进了FMDV和SVA的复制。同时,RT-qPCR进一步表明与FMDV和SVA感染期间的PK-15细胞相比,PK-15-TPL2^-/-细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达明显降低。综上所述,本研究成功构建了TPL2基因敲除的PK-15细胞系,与对照细胞相比,TPL2基因的敲除更利于FMDV和SVA的复制,这可能与IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56表达的抑制有关。本研究提示CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为在动物和疫苗开发过程中编辑细胞系以提高病毒产量的有效工具,本结果为进一步提升FMDV和SVA产量指明了方向,也为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供了良好的生物材料。     

野生盘羊×巴什拜羊杂交二代尾部脂肪差异表达lncRNA的鉴定与分析

【目的】 分析不同脂尾型绵羊尾部脂肪组织中的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,探究lncRNA与绵羊尾部脂肪沉积机制的关系,为揭示绵羊尾脂沉积机制提供理论依据。【方法】 选择新疆地方绵羊巴什拜羊(肥尾型)和野生盘羊×巴什拜羊杂交二代(小尾型)作为研究对象,采集2个群体尾部脂肪组织,利用转录组测序技术筛选差异表达lncRNA并预测靶基因,对其进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用实时荧光定量PCR技术验证转录组测序的表达结果。【结果】 通过差异表达分析共筛选出728个差异表达lncRNAs,其中270个表达下调,458个表达上调;通过差异表达lncRNA靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析,筛选到634个靶基因参与疾病、免疫、蛋白修饰、细胞代谢等相关功能分类,共涉及76条信号通路,部分lncRNA介导的靶基因SCD、GPAM、THRSP、FASN等与绵羊尾部脂肪沉积相关。实时荧光定量PCR与转录组测序结果趋势相同。【结论】 lncRNA在绵羊脂尾进化中对尾部脂肪沉积具有重要的调控作用,为从lncRNA的角度分析绵羊脂肪沉积提供了理论依据。     

影响山羊产羔数lncRNA的筛选及功能分析

旨在分析高、低繁殖力川中黑山羊卵巢组织中长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）的表达谱,探讨lncRNA与山羊生殖调控的关系,为解释lncRNA在山羊繁殖调控中的分子机制提供理论依据。本研究选择3胎以上的10头健康川中母羊（3.5~4.5岁）,将其分为高繁组和低繁组。高繁组为每胎产羔数在2头以上的母羊（n=6）,低繁组为每胎产羔数为1头的母羊（n=4）。同期发情后,采集高繁和低繁山羊的卵巢样品,并从中提取总RNA构建测序文库,通过HigSeq X ten平台进行测序,筛选出差异lncRNAs,通过对差异显著的lncRNAs与mRNAs位置关系以及结合能的判定预测顺式作用的靶基因,并对其进行GO和KEGG通路分析。最后,随机抽取6个差异lncRNAs进行实时荧光定量验证。结果表明,本研究共鉴定出168个差异表达lncRNAs,其中,163个lncRNAs在高繁组卵巢显著上调,5个lncRNAs在低繁组卵巢显著上调。筛选出的差异表达lncRNAs可能为调控山羊繁殖力的候选lncRNAs,包括ENSCHIG00000001479、ENSCHIG00000002617和ENSCHIG00000002622等。这些候选lncRNAs的靶基因（MYC、CDH2、FGF9、PPARGC1A等）主要富集于Jak-STAT、细胞黏附分子及AMPK等信号通路,ENSCHIG00000001479的靶基因MYC参与了Jak-STAT、TGF-β和MAPK通路;ENSCHIG00000002617和ENSCHIG00000002622的靶基因CDH2参与了细胞黏附分子通路。通过qRT-PCR验证发现,定量结果与测序结果基本一致。研究结果推断,ENSCHIG00000001479、ENSCHIG00000002617和ENSCHIG00000002622等lncRNAs可能对山羊生殖发育过程中的卵巢发育及排卵等进程具有重要的调控作用,认为鉴定出的差异表达lncRNAs与山羊产羔数有关。本研究利用RNA-Seq技术筛选高、低繁殖力山羊的差异表达lncRNAs,并对其进行GO和KEGG功能分析,为探讨山羊产羔数的繁殖机制提供更完善的转录组数据。     

鸭肠炎病毒感染鸭肝脏组织miRNA表达谱差异分析

为探究鸭感染鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）后肝脏miRNA表达谱的差异,试验以DEV-GZ株经腿部肌肉接种30日龄麻鸭,于感染后66、90和114 h采集鸭肝脏组织样本,提取组织总RNA,经质检合格后,采用高通量测序技术对对照组和试验组样品进行miRNA测序,筛选出DEV感染鸭肝脏组织的差异表达miRNA,对其进行生物信息学GO功能分类和KEGG信号通路分析,并随机选取部分差异表达miRNA进行实时荧光定量PCR验证。结果显示,鸭感染DEV后66、90和114 h,肝脏组织差异表达miRNAs数量分别为227、225和231个。GO功能注释显示,感染鸭肝脏差异表达miRNA在生物过程分类中主要为细胞过程、单有机体过程和代谢过程类别;在细胞成分分类中主要是细胞、细胞部分和细胞器类别;在分子功能分类中主要是绑定分子功能和催化活性功能类别。KEGG通路富集显示,差异表达miRNA主要涉及PI3K-Akt、JAK-STAT、磷脂酰肌醇信号通路系统、ECM-受体相互作用、MAPK、Wnt、Toll样受体、IL-17、脂质代谢、钙离子信号通路和cAMP等信号通路,其中感染66 h差异表达miRNA主要在生物系统及神经系统中发挥作用;感染90 h主要在内分泌系统及消化系统中发挥作用;感染114 h主要在全身生物、免疫和消化系统等中发挥作用。选取10个差异表达miRNAs进行实时荧光定量PCR验证,结果与高通量测序结果一致。表明DEV感染对鸭肝脏组织miRNA表达具有显著影响,为从宿主miRNA角度揭示DEV致病机制提供了参考依据。