从猪毛囊中快速提取基因组DNA的有效方法

采用酚仿抽提法提取猪毛囊中的基因组DNA,并以此为模板进行猪骨形态发生蛋白7基因(BMP7)片段的扩增鉴定,优化建立一种快速、简单提取动物基因组DNA的方法。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,从猪毛囊中提取的基因组DNA纯度、质量浓度较高,能满足PCR扩增需要。提取DNA所用猪毛囊数量以10根为好。用毛囊提取动物基因组DNA简便、经济,能够在短期内获得群体基因组DNA,且不会对动物造成损伤。     

单细胞测序对绒山羊毛乳头细胞的鉴定

【目的】 基于单细胞测序技术探究绒山羊毛乳头细胞标记基因,优化毛乳头细胞体外鉴定的方法,为研究绒山羊毛囊发生发育提供良好的细胞模型。【方法】 运用Seurat单细胞分析法分析陕北白绒山羊胚胎期60、90、120 d皮肤组织的单细胞测序数据。原始数据经质控、过滤、标准化后,采用UMAP方法进行数据降维与聚类分析。通过对比已报道的毛囊相关标记基因,获得完整绒山羊毛囊细胞类群谱系信息。通过基因差异表达分析,筛选绒山羊毛乳头细胞特异性标记基因。利用免疫荧光试验鉴定标记蛋白在绒山羊皮肤组织中的表达与分布情况,进一步筛选毛乳头区域特异性表达蛋白。体视镜下机械分离完整绒山羊毛囊,采用酶消化法分离绒山羊毛乳头区域并在体外培养至细胞分离,最终通过差速贴壁法纯化细胞。待毛乳头细胞纯度较高时,利用免疫荧光试验验证候选标记蛋白在分离细胞中的表达情况。【结果】 从单细胞水平分析了绒山羊毛囊发生过程中涉及的关键细胞转录信息,成功获得绒山羊皮肤中的17个主要细胞类群信息,鉴定出包括真皮细胞谱系、表皮细胞谱系、毛乳头细胞、毛干细胞、内根鞘细胞等绒山羊皮肤结构关键细胞类群,以及周皮细胞、巨噬细胞、肌肉细胞等其他功能细胞类群。筛选获得毛乳头细胞特异性基因427个,包括SOX2、FGF7、APOD、BMP3、HHIP、HEY2和SPON1等,这些基因在绒山羊毛乳头细胞中的表达丰度远高于其他细胞类型,被认为是毛乳头细胞特异性标记基因。组织免疫荧光试验进一步证明SOX2、FGF7与APOD等蛋白在绒山羊毛乳头区域内特异性表达,可用于皮肤组织中绒山羊毛乳头细胞的定位。此外,本研究在成功分离单根绒山羊次级毛囊的基础上,实现了绒山羊毛乳头区域的贴壁培养,成功观测到大量细胞从毛乳头区域逐步迁移分离的过程。细胞免疫荧光试验结果显示SOX2、FGF7与APOD均在绒山羊毛乳头细胞中表达,且SOX2阳性细胞约占毛乳头细胞总量的76%左右,而FGF7和APOD阳性细胞则占98%以上。结合绒山羊皮肤组织免疫荧光定位结果,SOX2、FGF7与APOD等标记可用于鉴定体外分离培养的绒山羊毛乳头细胞。【结论】 利用单细胞测序技术描述了绒山羊主要皮肤细胞的转录组信息,筛选出毛乳头细胞特异性表达基因。经免疫荧光试验证实,单细胞测序鉴定标记基因的方法简单高效,且具备较高准确率。筛选的SOX2、FGF7与APOD不仅为绒山羊毛乳头细胞体内定位提供了有效的标记,而且为多标记鉴定毛乳头细胞提供可能,更为进一步研究毛囊发育相关基因的功能及调控机制奠定重要基础。     

乌骨山羊皮肤黑色素细胞的分布及特征

试验采用免疫组织化学染色对乌骨山羊不同被毛颜色皮肤中的黑色素细胞进行定位,再用多巴组织化学染色法对皮肤中有黑色素分泌的黑色素细胞进行定位,以HE染色法对黑色素细胞的形态进行观察。免疫组织化学染色结果显示,乌骨山羊皮肤中的黑色素细胞主要分布在表皮基底层和毛囊中;多巴组织化学染色结果显示,表皮中没有阳性反应,黑色被毛毛球部及外根鞘均有阳性反应,白色被毛毛球部及外根鞘则没有阳性反应,说明黑色被毛毛球部及外根鞘有成熟的黑色素细胞存在并能合成黑色素。HE染色结果显示,黑色被毛毛囊外毛根鞘中的黑色素细胞和周围细胞区分明显,呈空泡状和活化状态,周围有大量黑色素颗粒分布,白色被毛毛囊外根鞘黑色素细胞呈椭圆状,没有黑色素产生,和周围细胞难以区分。因此,乌骨山羊黑色被毛毛囊外根鞘中黑色素细胞的活化可能参与了乌骨山羊毛色和乌质性状的形成。     

一氧化氮合酶异构体在不同毛色羊驼皮肤毛囊中的存在差异

【目的】研究羊驼皮肤毛囊中一氧化氮合酶(nitric oxide synthases,NOS)的存在差异。【方法】Dopa染色定位黑色素细胞;利用免疫组化和免疫印迹技术对不同毛色羊驼皮肤毛囊中NOS进行定位与定量分析,分析NOS在不同毛色羊驼皮肤毛囊中表达的差异。【结果】Dopa染色显示黑色素细胞存在于羊驼毛囊鞘和毛乳头中。免疫组化结果显示3种NOS在白毛组和棕毛组皮肤毛囊中均有阳性产物。NOS1和NOS3表达呈弱阳性,NOS2表达呈强阳性;NOS1在毛乳头细胞无阳性产物,在白毛组毛囊鞘细胞与棕毛组无显著差异(P0.05);NOS2在棕毛组毛囊鞘细胞与白毛组无显著差异(P0.05),在棕毛组毛乳头细胞极显著高于白毛组(P0.01);NOS3在毛囊鞘细胞无阳性产物,在白毛组毛乳头细胞与棕毛组无显著差异(P0.05)。免疫印迹显示NOS2在棕毛组显著高于白毛组(P0.05)。【结论】NOS2参与调节羊驼毛色形成,为NO信号调节羊驼毛色形成机制的研究提供试验数据。     

毛豹皮樟的叶片DNA提取及其RAPD引物筛选

以毛豹皮樟叶片为材料,对其DNA提取方法和RAPD引物的筛选进行了研究.结果表明,采用改良SDS法从毛豹皮樟的老、幼叶片中都能提取到高质量的DNA,可以用于RAPD分析;从4组随机引物中筛选出了16个显示毛豹皮樟遗传差异的多态性引物.     

EDA及受体EDAR在胚胎小鼠背部毛囊形成期的表达

毛囊是皮肤的附属器官之一。有研究表明外胚层发育不全基因(ectodysplasin A,EDA)是毛囊、牙齿和腺体等器官发育所必需的,EDA及其受体EDAR可以参与并调节毛囊不同时期的发育。[目的]探究EDA和EDAR对小鼠背部毛囊形成的作用。[方法]试验采用苏木精-伊红(HE)染色和免疫组织化学方法,观察小鼠胚胎期第13～18天背部毛囊形成过程中组织结构特征以及EDA和EDAR蛋白在此期间的表达。[结果]HE染色试验结果显示不同天数胚胎小鼠背部毛囊结构有如下变化:细胞排列逐步紧密,层数逐渐增多;皮肤毛胚逐渐凸起,形成基板,并逐步发育成毛钉,进而形成未成熟毛囊。免疫组织化学试验结果显示EDA和EDAR蛋白在表层细胞、基底层、基板、毛芽、毛钉、未成熟毛囊和真皮中均有表达。[结论]EDA可能对毛囊形成的启动有促进作用,且可能促进毛钉的形成和未成熟毛囊的发育;EDAR则可能对表皮的分化有诱导作用,且可能对毛钉的形成和发育有促进作用。     

FGF7亚家族在胚胎期小鼠毛囊形成过程中的差异表达

为了研究FGF7亚家族(FGF7/FGF10/FGF22)在胚胎小鼠毛囊形成过程中的作用,选取胚胎期(13～17 d)小鼠,采用免疫组织化学和蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测小鼠胚胎毛囊形成不同阶段皮肤组织中FGF7/FGF10/FGF22的蛋白表达。结果显示,FGF7/FGF10/FGF22在毛胚细胞、毛钉、球根状毛钉、表皮和真皮细胞中均有表达,但FGF7在14日龄的胚胎皮肤中表达量最高,FGF10在15日龄的胚胎皮肤中表达量最高,FGF22在17日龄的胚胎皮肤中表达量最高。结果提示,FGF7亚家族3个成员在胚胎小鼠毛囊形成过程中均可发挥重要作用,FGF7在毛囊形成的启动阶段即胚胎期第14天发挥主要作用,可能参与指导毛胚细胞的增殖;FGF10在毛囊形成的关键阶段即胚胎期第15天发挥主要作用,可能参与指导毛钉和球根状毛钉的形成;FGF22在毛囊的基本形成阶段即胚胎期第17天发挥主要作用,可能促进毛钉成熟。     

几种提取乌苏里貉毛囊核酸方法的比较(英文)

[目的]该研究旨在探讨提取乌苏里貉毛囊核酸的可靠方法。[方法]本实验分别利用改进的有机酚法,chelex-100法,PCR缓冲液法和试剂盒法,从乌苏里貉毛发中提取核酸DNA,对所提核酸进行PCR扩增及电泳分析,并且对四种方法进行比较。[结果]经分光光度计测定和凝胶电泳检测,本实验研究结果表明chelex-100提取的核酸有蛋白质等杂质,PCR缓冲液法提取核酸浓度低有机酚法和试剂盒法提取的DNA浓度高,且没有杂带。[结论]本研究为进一步探索高效,简便的提取乌苏里貉毛囊核酸DNA提供了有力的科学理论基础。     

獭兔被毛密度测定研究

利用5张生獭兔皮,测定了其5个部位即颈部、背部、肩部、腹部及体侧部的被毛密度,用冰冻切片法切好片子,在光学显微镜下计数固定面积下的毛囊数,再换算成单位面积下的毛囊数,即被毛密度。结果表明:不同个体和不同部位的被毛密度差异较大。     

内蒙古绒山羊次级毛囊组织形态周期性变化研究

【目的】研究成年绒山羊次级毛囊组织形态的周期性变化过程,为研究绒山羊绒毛生长的分子调控机理奠定组织学基础。【方法】制作内蒙古绒山羊1年周期内每个月的皮肤组织切片,染色后显微镜下观察照相。【结果】成年绒山羊次级毛囊形态在一年中呈周期性变化,在兴盛期、退行期和休止期的形态各不相同。从4月份开始,次级毛囊外根鞘细胞向下分裂延伸,开始了毛囊的重建;8～9月份毛囊完成重建,毛囊结构完整;10月份毛球细胞停止分裂,毛乳头萎缩,大量细胞程序化死亡,毛根上移,毛囊进入退行期;12月份毛囊根部上升到皮脂腺附近不再变化;翌年1～3月毛囊的形态基本没有变化。【结论】了解了成年绒山羊次级毛囊1年内形态的周期性变化过程,为绒山羊绒毛相关领域的研究提供一定的借鉴。     

云南茶树DNA提取和RAPD分子标记初探

 以宜良宝洪茶、莽水大叶原头茶、波上金苔、云抗10号4个云南茶树品种为材料,对其DNA提取和RAPD分子标记方法进行了研究。结果表明：所采用的经改进的CTAB DNA微量提取法,可以得到高质量的茶树DNA,分子量大于21 kb,可满足RAPD扩增;用18个不同的随机引物对所提取的4个品种基因组DNA进行了RAPD分子标记分析,其中3个（占16.67%）引物在茶树品种间可扩增出多态性产物。建立了云南茶树DNA微量、快速提取和RAPD标记的分析程序,为RAPD分析应用于云南茶树遗传研究打下了良好的基础。     

基于RAPD标记分析葱属7个栽培品种的遗传多样性

[目的]利用RAPD标记分析葱属7个栽培品种的遗传多样性。[方法]采取改良CTAB法提取植物的总DNA,从68个RAPD引物中筛选出25条具有多态性且扩增稳定的引物用于品种的DNA多态性分析,采用优化后的RAPD的PCR反应体系进行PCR扩增。利用MEGA4软件进行各品种间UPGMA聚类分析。[结果]从25个引物中共扩增出245条DNA带,其中99条为多态性带。根据聚类分析,葱属7个栽培品种可分为2类：汉中冬韭、阜丰1号和豫韭2号为1类;其他4个为1类,其中怀化大蒜和南宁大蒜、连葱6号和杭州分葱各为1小类;7个品种的相似系数范围为80．2％～99．8％。该聚类结果与依据表型特征的传统分类的结果一致。[结论]该研究为准确地进行葱属植物种质资源的鉴定、筛选和利用提供了科学依据。     

不同地区主要栽培宁夏枸杞品种的RAPD分析

利用RAPD分子标记技术,从400条10碱基的随机引物中筛选出了40条适用于枸杞RAPD分析的引物,选取其中9条引物对10份不同来源的宁夏枸杞材料进行了扩增,检测了宁夏不同地区种植的宁夏枸杞(Ly cium barbarum L.)主栽品种和新育成的枸杞品系基因组DNA的多态性,并对其遗传背景进行了初步分析。结果表明,宁夏不同地区主要栽培的宁夏枸杞品种遗传上无明显差异,但新品系大果枸杞与标准宁杞1号在基因组上有差异;同时构建了主要推广品种宁杞1号的RAPD图谱。     

羌活基因组DNA提取方法

[目的]探索一种用于RAPD分析的羌活基因组DNA提取方法。[方法]分别采取CTAB法S、DS法和改良的CTAB法提取羌活基因组DNA,通过紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳和RAPD分析对提取的DNA进行检测。[结果]3种方法均能有效地从羌活中获得较高产量的DNA,以改良的CTAB法所得的DNA纯度最高,此法提取的羌活基因组DNAOD260/OD280为1.8~2.0,DNA干重得率约为0.235μg/mg。[结论]改良的CTAB法更适于羌活基因组DNA的提取,可以完全满足RAPD扩增的需要。     

平胸龟2个地理种群遗传差异的比较

利用25个随机引物对平胸龟2个种群共49个个体分别进行PCR扩增,结果显示:平均每个个体扩增出209条DNA带,平均每个引物可产生8条带,扩增谱带分子质量大小在100～2000 bp之间,多态性比例为72.13%.其中12条引物扩增出16个特异于不同种群的DNA片段,可作为鉴别广东或福建种群的分子标记.用RAPD1.04和Genepop3.2软件分析所得谱带,得出广东、福建2个地理种群的平胸龟具有较高的遗传多样性,且广东种群的遗传多样性高于福建种群.2个种群间的平均遗传距离为0.278 6±0.025 9,遗传分化指数Gst为0.285 7.NJTREE聚类分析显示广东和福建2个地区的平胸龟各自聚成2个类群,有较明显的种群分化.     

石鲽基因组DNA的提取及其RAPD体系的优化

[目的]研究石鲽基因组DNA的提取及其RAPD体系的建立和优化。[方法]以石鲽为试材,按常规酚/氯仿抽提法提取其基因组的DNA,对影响RAPD反应的各因素进行优化,建立了石鲽的最佳RAPD反应体系和程序。[结果]采用常规酚/氯仿抽提法获得的DNA完全能够满足RAPD分析的要求。通过优化建立一套适合石鲽的稳定的RAPD反应体系:反应体系总体积为25μl,包括10×buff-er2.5μl,MgCl22 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.2μmol/L,模板30 ng,Taq酶1 U。扩增程序为:94℃预变性5 min,45次PCR循环(94℃变性45 s,36℃退火45 s,72℃延伸2 min和72℃延伸10 min。利用该体系对OPK和OPV系列共40条引物进行扩增,发现其中部分引物能产生稳定、清晰的条带。[结论]该体系为石鲽遗传多样性以及相关分子标记的研究奠定了基础。     

不同年份采收的豇豆种子的RAPD研究

ＲＡＰＤ是一种建立在ＰＣＲ基础之上的新的分子标记技术，利用ＲＡＰＤ技术对不同年份采收的豇豆种子进行了研究从豇豆干种子中直接提取的基因组ＤＮＡ可以用于ＲＡＰＤ分析在２０种１０ｂｐ随机引物中筛选出Ｓ２０７和Ｓ２０８２种引物，并获得了豇豆基因组ＤＮＡ的指纹图谱筛选出的２种引物均只在１９９７年采收的豇豆种子的基因组ＤＮＡ上扩增出１条ＤＮＡ带研究结果表明，不同年份采收的豇豆种子在遗传性上相当一致，而豇豆种子的基因组ＤＮＡ在贮藏过程中会受到损伤     

马铃薯晚疫病菌A2交配型与DNA多态性相关关系研究

利用RAPD方法初步研究了马铃薯疫病菌DNA多态性与A2交配型的关系，共用27个有多态性的引物对22个菌株进行了扩增，共扩增出275条有多态性的DNA谱带用于统计分析。聚类分析结果显示，阈值为8时，将供试的22个菌系划分为4个类群，10个A2交配型菌系中的8个均在第Ⅳ类群中，由此认为该病菌的DNA多态性与A2交配型有一定相关性。同时还发现各地的晚疫病菌系有不同程度的群体分化现象。     

优化麝香百合RAPD反应体系的研究

[目的]建立适合百合种质的RAPD优化体系。[方法]从麝香百合中提取基因组DNA,进行RAPD反应。通过正交试验设计,优化麝香百合的RAPD反应条件和反应体系。[结果]优化的RAPD反应条件为:DNA 50 ng,Primer 0.3μmol/L,Taq酶1.0 U,dNTPs 200μmol/L,Mg2+3.0 mmol/L。在麝香百合的RAPD扩增程序中,各因素显著性程度依次为:循环次数>延伸时间>复性温度>复性时间。麝香百合的最佳RAPD反应程序为:37℃复性50 s,延伸60 s,循环35次。[结论]该研究建立了一套稳定的RAPD反应体系,具有较好的扩增效果。     

东北地区野生百合遗传多样性的RAPD分析

应用RAPD标记对中国东北地区6种3变种共34份野生百合试材的遗传多样性进行研究.筛选12个随机引物对其总DNA进行扩增,共扩增出101条带,其中83条带具多态性,多态性比率为82.1%,平均每个引物扩增出6.9条多态性谱带.基于 RAPD标记,利用 UPGMA构建了聚类树状图,34份野生百合资源的Nei&Li相异系数介于 0.013 7与0.601 3 之间.结果表明,中国东北地区野生百合具有丰富的遗传多样性,聚类树状图将34份试材分为2大类,第1类包括细叶百合和垂花百合,共5份试材,第2类包括卷丹、毛百合、有斑百合、大花百合、大花卷丹、朝鲜百合和东北百合,共29份试材;卷丹与有斑百合的亲缘关系较近,而与同为卷瓣组的朝鲜百合、细叶百合、大花卷丹等亲缘关系较远.细叶百合与垂花百合亲缘关系较近.