枇杷β-胡萝卜素羟化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物β-胡萝卜素羟化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以枇杷基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约450 bp的DNA片段,克隆人pMD-18T载体中,测得该基因片段长为440 bp,编码145个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在GenBank中进行同源性检索,结果该序列与苹果β-胡萝卜素羟化酶基因同源性为95%,证明它属于枇杷的β-胡萝卜素羟化酶基因。     

桂花β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为揭示桂花不同品种β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,HYB)基因的序列差异,利用已构建的桂花花瓣转录组数据库中Unigene序列信息,结合RT-PCR技术对桂花品种玉玲珑、金球桂、堰虹桂和日香桂中2个β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB1和HYB2)的最大阅读框进行扩增,并测序验证。生物信息学分析结果表明,4个桂花品种HYB1基因均含有长为909 bp的开放阅读框,编码302个氨基酸残基; HYB2基因均含有长为915 bp的开放阅读框,编码304个氨基酸残基。4个桂花品种HYB1和HYB2推导的氨基酸序列均具备保守的组氨酸结构域。HYB1基因核苷酸序列存在27个变异位点,其氨基酸序列存在8个变异位点; HYB2基因核苷酸序列存在12个变异位点,其氨基酸序列存在3个变异位点。进化树分析结果发现,4个桂花品种的HYB1和HYB2蛋白与茄科植物番茄和辣椒HYB蛋白亲缘性最高。     

烟草转录因子NtMYB42基因的克隆与分析

【目的】克隆烟草木质素生物合成途径调控基因NtMYB42,为烟草品质改良提供参考依据。【方法】利用同源克隆法从栽培烟草K326克隆出NtMYB42基因全长序列和cDNA序列,研究分析NtMYB42基因的结构、编码蛋白理化性质、亚细胞定位和同源性等。【结果】NtMYB42基因组和cDNA全长分别为2 312bp和1 130bp,包含2个外显子和1个内含子,编码281个氨基酸,分子量为31.79kD,等电点pI为5.18,预测有3个糖基化位点和18个磷酸化位点;NtMYB42与SlMYB42等植物MYB42蛋白同源性水平较高,与SlMYB42一致性达82.6%。【结论】从K326中克隆出NtMYB42基因全长序列和cDNA序列,NtMYB42是番茄SlMYB42、矮牵牛PnODO1和拟南芥AtMYB42的同源基因,是烟草木质素合成途径调控的重要候选基因。     

金柑LEAFY同源基因克隆与全序列分析

通过PCR扩增，从融安金柑基因组DNA中克隆出一条2361bp的DNA片段，该DNA克隆含有1个2081bp的LEAFY同源基因全长序列（FcLFY）。金柑LEAFY同源基因包含2个内含子和3个外显子，编码398个氨基酸。比对结果表明，金柑LEAFY同源基因与甜橙、枳的LEAFY同源基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为98％。该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。     

贵州矮马与伊犁马生长激素基因5’侧翼区的结构特征

为了摸索贵州矮马生长发育的调控机制,探明贵州矮马与伊犁马生长激素基因5’侧翼区的结构特征,以4～5龄的贵州矮马和7～8龄的新疆伊犁马为研究对象,采用直接测序法从两种马基因组中克隆了生长激素(GH)基因5’侧翼区的DNA序列,并进行生物信息学分析。结果表明:1)从基因组中克隆的711bp片段为GH基因5’侧翼区序列;2)两个马品种的GH基因5’侧翼区中都存在TATA box、CAATbox、GC box和Octamer位点等真核生物启动子结构;3)从伊犁马GH基因5’侧翼区中检测到1个位于30bp处的突变位点发生了G→C颠换,由此新增了1个转录因子upstream stimulatory factor(USF)结合位点;4)从贵州矮马和伊犁马GH基因的5’侧翼区序列中发现了MZF1、CdxA、Nkx-2、AML-1a和c-Myc等19种共58个转录因子的结合位点。结论:克隆的711bp基因序列中存在大量的转录调控元件。     

甘蓝型油菜△12-脂肪酸脱氢酶基因(BnFAD2)cDNA序列的克隆及其对烟草的转化

通过PCR方法从甘蓝型油菜基因组DNA中克隆出△12-脂肪酸脱氢酶基因BnFAD2的cDNA序列,全长1155bp,编码384个氨基酸,测序结果表明该基因与GenBank已登录的甘蓝型油菜FAD2基因(AF243045)的相似性为99%.将其克隆到植物表达载体pZP212上,利用农杆菌介导法转化烟草NC89品种,经卡那霉素筛选和PCR鉴定,得到阳性植株15棵.     

枇杷黄肉和白肉突变体类胡萝卜素基因的克隆和表达分析(英文)

[目的]探索黄肉枇杷果实类胡萝卜积累的调控机制。[方法]该研究以枇杷突变体(黄肉枇杷一枝芽变结出白肉果实)为供试材料,利用高效液相色谱测定成熟果肉中β-胡萝卜素的积累,对野生型和突变型枇杷类胡萝卜素合成途径基因进行同源克隆及表达分析。[结果]野生型黄肉和突变体白肉枇杷成熟果肉中β-胡萝卜素含量分别为60.9和4.6μg/g;利用同源克隆获得的5个枇杷类胡萝卜素合成基因编码区序列在野生型和突变型没有发现核苷酸变异;实时荧光定量PCR分析显示类胡萝卜素β环羟化酶基因在突变体白肉果实中的表达显著降低,其它6个类胡萝卜素合成途径基因在两供试材料中的表达水平没有差异,与β-胡萝卜素的积累没有直接关联。[结论]突变体白肉枇杷缺少β-胡萝卜素的积累可能与类胡萝卜素β环羟化酶基因表达量下调有关。     

油松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

利用同源克隆的方法,从油松(Pinus tabulae ormis)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的cDNA和DNA序列,cDNA序列全长2 157 bp,编码718个氨基酸,包含有完整的ORF,命名为TaPAL(GenBank登录号:JX280460).通过核苷酸序列多重比较表明,TaPAL基因与其他植物PAL基因高度同源,预测的蛋白序列包含与水稻、玉米PAL相同的脱氨基位点和催化活性位点.PAL系统进化树显示,TaPAL与松科类植物PAL聚类关系最近.另外,对比发现TaPAL基因组DNA序列与cDNA序列完全一样,表明该基因无内含子.     

牧羊犬IFN-β基因的克隆和序列分析

为对犬干扰素-β(IFN-β)进行研究,用PCR技术从犬血细胞基因组DNA中扩增了牧羊犬IFN-β基因,并克隆到pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,阳性克隆经PCR和酶切鉴定后进行测序。结果表明:牧羊犬IFN-β基因含561bp,编码186个氨基酸,前21个为信号肽。成熟蛋白理论分子量为20kD,等电点为5.737,有2个潜在磷酸化位点、5个N糖基化位点和4个半胱氨酸残基,大部分为亲水区。二、三级结构预测显示,蛋白主要由5段α螺旋组成。犬IFN-β基因与赤狐的完全相同,与貉、雪貂和猫的同源性很高(85%～98.4%),在进化树中处于同一分支,而与禽类和鱼类的同源性仅为2.9%～8.6%。     

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析

 【目的】克隆蜡梅凝集素基因并研究其抗蚜虫和抗蛞蝓活性,为植物抗虫基因工程提供理论依据和试验材料。【方法】通过随机挑选克隆测序的方法,从蜡梅花cDNA文库中克隆蜡梅凝集素基因,并构建植物表达载体,用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,并对转基因植株进行抗蚜和抗蛞蝓试验。【结果】从蜡梅花cDNA文库中克隆到了一个凝集素基因CpLEC(GenBank登录号：DQ352145),该基因全长871 bp, ORF框长558 bp, 编码185个氨基酸。该基因DNA分析表明其不含内含子。具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,有2个典型的甘露糖结合位点(QXDXNXVXY),和1个变异的可能结合位点(HXGXNXVXY)。Southern杂交表明,该基因在蜡梅基因组中为多拷贝。构建了35S启动子控制下的CpLEC基因的植物表达载体pBI121-CpLEC,利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明,CpLEC基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明,转基因植株及其离体叶片有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率分别为60%和68%。抗蛞蝓试验结果表明转基因植株有明显的抗蛞蝓活性,转基因烟草虫害指数为0.17,远低于非转基因烟草的虫害指数0.96。【结论】克隆获得了蜡梅凝集素基因CpLEC,通过转基因手段分析其抗蚜和抗蛞蝓活性,结果表明该基因对抗虫基因工程有重要的应用价值。     

牧羊犬IFN-β3基因的克隆和序列分析

为对犬干扰索-β(IFN-β)进行研究,用PCR技术从犬血细胞基因组DNA中扩增了牧羊犬IFN-β基因,并克隆到pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,阳性克隆经PCR和酶切鉴定后进行测序.结果表明:牧羊犬IFN-β基因含561bp,编码186个氨基酸,前21个为信号肽.成熟蛋白理论分子量为20kD,等电点为5.737,有2个潜在磷酸化位点、5个N糖基化位点和4个半胱氨酸残基,大部分为亲水区.二、三级结构预测显示,蛋白主要由5段α螺旋组成.犬IFN-β基因与赤狐的完全相同,与貉、雪貂和猫的同源性很高(85％～98.4％),在进化树中处于同一分支,而与禽类和鱼类的同源性仅为2.9％～8.6％.     

烟草谷氧还蛋白基因NbGRX1的克隆与表达特性分析

采用同源克隆及cDNA末端快速扩增法(RACE),从烟草中克隆到1个谷氧还蛋白基因(Grx),命名为NbGRX1.该基因全长1 021 bp,编码298个氨基酸,具有典型的Grx基因结构域.Real-time RT-PCR分析表明,该基因能在烟草的根、茎、叶中表达,并且受低温、干旱和高盐诱导.     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

激发子诱导的过敏性细胞死亡调控基因的筛选

采用病毒诱导基因沉默技术从本氏烟(Nicotiana benthamiana)cDNA文库中筛选受3种不同激发子(Nep1、harpin和INF1)诱导的过敏性细胞死亡的调控基因。以农杆菌Gv3101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有7 000个单克隆的本氏烟cDNA文库,采用牙签刺伤法和注射接种法,从6 000个克隆中筛选到了34个能使激发子诱发的过敏性细胞死亡表型发生改变的克隆。对上述阳性克隆进行序列测定和分析,发现其中13个与已知的基因具有较高的同源性,其中克隆Nb14-4编码1个特异的ALY蛋白;克隆Nb3-9和Nb4-26分别编码1个苹果酸脱氢酶和果糖二磷酸醛缩酶;Nb4-28编码普通烟草中的14-3-3 d-2蛋白。还有21个克隆在公共数据库中没有同源基因。上述结果表明:利用病毒表达载体建立cDNA文库,并采用病毒诱导基因沉默技术可从烟草全基因组内筛选受不同激发子诱导的过敏性细胞死亡的调控基因,为揭示植物过敏性细胞死亡分子机制提供试验依据。     

烟草CENH3-1和CENH3-2基因克隆及表达分析

【目的】克隆栽培烟草K326着丝粒特异组蛋白(Centromeric histone H3, CENH3)基因，并对其进行生物信息及表达特性分析，为探明NtCENH3基因的单倍体诱导功能及烟草品种快速改良提供依据。【方法】以栽培烟草K326为材料，利用同源克隆技术获取NtCENH3-1和NtCENH3-2基因的cDNA全长序列，运用生物信息学软件分析蛋白的序列特征；通过亚细胞定位技术验证基因的表达部位；利用荧光定量PCR检测NtCENH3-1和NtCENH3-2基因在烟草不同组织部位的表达情况。【结果】NtCENH3-1和NtCENH3-2包含7个外显子和6个内含子，编码区(CDS)长度分别为468 bp和471 bp,分别编码156个和157个氨基酸，蛋白的分子量分别为17.64 kDa和17.75 kDa。进化树分析表明，栽培烟草CENH3-1和CENH3-2基因分别来源于祖先种绒毛烟草和林烟草，2个基因均定位于细胞核中。RT-PCR分析显示，NtCENH3-1和NtCENH3-2在不同组织中呈差异性表达，且在雌蕊及幼嫩的果实中表达量较高。【结论】在烟草中成功克隆着丝粒特异组蛋白N...     

Aspergillus niger 乳糖酶基因的克隆及序列分析

利用PCR及RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)菌株DL116中克隆到了乳糖酶基因组DNA,cDNA序列(GENBANK ACCESSION No.EF103141)。序列分析表明,乳糖酶基因组DNA序列长3368bp,其中含有8个内含子,cDNA编码区长2967bp,共编码988个氨基酸,氨基酸序列中共含有12个潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行了同源性比较。     

枇杷LEAFY同源基因的克隆及序列分析

为从分子水平研究枇杷成花的机理,通过分析植物花分生组织决定基因LEAFY(LFY)同源基因的保守区序列,设计了1对简并引物,用PCR方法从枇杷栽培品种‘早钟6号’基因组DNA中扩增出1个1317bp的片段,把该片段克隆到pUCm-T载体,测序和序列分析结果表明获得了枇杷LFY同源基因(ejLFY)3’端的1个片段,该片段有1个911bp的内含子,编码区共编码130个氨基酸,其序列已经在GenBank中登记(登录号为AY551183)．在GenBank中进行同源性搜索,发现该基因片段与其他作物中已经报道的LFY同源基因的同源性大都在94％以上,特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高,达到98％的同源性,推测它们具有相似的功能．     

茄红素-β-环化酶反义RNA基因对烟草的遗传转化

采用农杆菌介导的叶盘法 ,用胡萝卜茄红素 -β-环化酶反义 RNA基因对烟草 SRI野生类型种及Xanthi品种进行了遗传转化。 GU S检测结果表明 ,胡萝卜茄红素 -β-环化酶反义 RNA基因对两个不同烟草材料的遗传转化率均为 4 1 .7% ;Xanthi Southern杂交的阳性率为 6 7% ;转基因烟草当代叶片组织中茄红素和胡萝卜素含量与对照植株不同