PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定

[目的]构建PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库,为深入研究猪伪狂犬病病毒(PRV)与宿主细胞间的相互作用机制打下基础.[方法]提取PK-15细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA(ds cDNA),并对其进行均一化和SfiI酶切处理.处理后的ds cDNA分别连接3种阅读框pGADT7-SfiI载体,将连接产物转化至大肠杆菌BH5α构建三框cDNA初级文库,取三框cDNA初级文库进行混合扩增,通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集文库细菌提取文库质粒.[结果]3种读码框cDNA文库的库容量分别为3.0× 106、2.0× 106和2.0× 106 CFU,文库实际扩增基数>150万CFU;一号和三号读码框的基因重组率均为100%,二号读码框的基因重组率大于93%.cDNA文库外源基因插入片段长度在500~3000 bp.cDNA文库质粒浓度约1.0 mg/mL,质粒收获量约3.0 mg.[结论]构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库具有较高的重组率和库容量,符合酵母双杂交筛选要求,可用于研究PRV与PK-15细胞间的相互作用机制.     

120日龄金华猪骨骼肌酵母双杂交cDNA文库的构建

选用Clontech SMART技术,在酵母菌株中构建猪骨骼肌全长cDNA文库,文库容量约为1.6×106cfu,插入的双链cDNA片段的长度在500～2 250 bp,文库重组比率为93.75%.该文库可以用于进一步的酵母双杂交筛选.     

鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

[目的]构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础.[方法]采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析.[结果]构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106 CFU,文库滴度为3.1×108 CFU/mL,插入片段大小集中在300~2000 bp,重组率为91.67%.以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9).[结论]通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据.     

鸡胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

选取对新城疫病毒(NDV)易感的鸡胚成纤维细胞(CEF),Trizol提取细胞总RNA,用SMART技术合成双链cDNA,然后利用同源重组的方法在酵母细胞内构建CEF的cDNA文库,以寻找与NDV基质(M)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,探讨其相互作用对NDV装配和出芽的影响.结果表明:提取的细胞总RNA的D260nm/D...     

盐胁迫下大麦酵母双杂交文库的构建与鉴定

为研究盐胁迫下大麦耐盐相关蛋白的互作蛋白,利用Gateway技术构建盐胁迫下大麦的酵母双杂交文库。首先提取受盐胁迫的大麦总RNA,分离mRNA并合成双链cDNA,并通过位点特异重组系统(BP重组)将双链cDNA转入pDONR22载体,构建初级文库。然后,将初级文库质粒通过同源重组转入pGADT7-DEST载体,构建次级文库。最后,将次级文库质粒转入酵母菌株Y187中构建酵母双杂交文库。经鉴定,该酵母双杂交文库的滴度为7.0×10~7 CFU/mL,插入cDNA片段平均长度大于1 000 bp,重组率大于95.8%。所构建的酵母双杂交文库质量较高,可用于后续的互作蛋白筛选工作。     

高温胁迫下匍匐翦股颖酵母cDNA文库的构建与鉴定

为深入挖掘匍匐翦股颖高温胁迫相关基因，本研究以高温处理的匍匐翦股颖叶片为试验材料，用Trizol法提取其总RNA，再用SMART技术进行双链cDNA的合成及回收纯化，并与pDONR222/pGADT7-DEST载体相连接，完成匍匐翦股颖酵母cDNA文库的构建。通过试验构建了质量较好的匍匐翦股颖酵母cDNA文库，文库容量为1.36×107 CFU，所插入的匍匐翦股颖平均片段长度> 1 000 bp，选取的24个克隆经过PCR检测全部能够显示出条带，重组率为100%。通过使用SMART技术建立酵母cDNA文库的方法，获得了质量较高的匍匐翦股颖cDNA文库，为研究匍匐翦股颖相关基因的蛋白筛选试验做准备。     

不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库的构建及筛选

[目的]构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库,筛选与细胞色素C还原酶铁硫蛋白(BcRISP1)互作的蛋白.[方法]从不结球白菜Pol胞质雄性不育花中提取总RNA,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA).采用SMART建库技术构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花全长cDNA文库.利用BcRISP1基因的开放阅读框,构建诱饵表达载体pGBK T-7-BcRISP1转化AH109酵母菌,根据酵母双杂交技术筛选出与BcRISP1互作的片段,并进行质粒共转化验证.[结果]经检测,文库的转化率为每μg pGADT7-Rec 1.80× 106转化子,文库滴度为1.21×107 CFU·mL-1,重组率为94％,成功构建可以用于酵母双杂交的cDNA文库.酵母双杂交技术获得了与BcRISP1互作的阳性克隆,试验表明诱饵载体表达产物对酵母无毒性作用,质粒共转化试验初步验证了BcRISP1与CYP81G、PIP2蛋白的互作关系.[结论]cDNA文库的成功构建为后期互作蛋白的顺利筛选奠定了基础,利用酵母双杂交技术成功获得与BcRISPl互作的蛋白CYP81G和PIP2,为明确不结球白菜Pol胞质雄性不育相关基因的信号传递通路提供更多的依据,以期从分子水平上进一步阐明不结球白菜Pol胞质雄性不育的机制.     

水稻抽穗期基因酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

为研究水稻开花调控的分子网络,构建了水稻品种中花11幼穗分化前倒二叶叶片的酵母双杂交cDNA文库。制备了高质量的总RNA,用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和Long Distance PCR合成双链cD-NA,通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株AH109中建立酵母双杂交所需的水稻倒二叶叶片cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的转化率为1.178×106/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.65×108 cfu/mL,重组率为94.7%,插入片段长度为350～2 000bp。该文库可用来筛选水稻抽穗期基因的互作蛋白。     

利用烟草的cDNA酵母表达文库筛选镉胁迫相关基因

为了鉴定烟草在重金属镉胁迫处理下的功能基因,构建烟草cDNA酵母表达文库,并利用镉敏感的突变株对文库进行初步筛选。首先将烟草幼苗进行重金属胁迫处理,然后取幼根提取总RNA并纯化mRNA,采用SMART技术反转录成双链cDNA,将cDNA与入门载体pDONR222的同源重组区连接,再转到酵母表达载体pDEST22上,构建了Gateway技术兼容的酵母cDNA表达文库。经检测,构建的cDNA酵母表达文库滴度为4.32×106 cfu/mL,库容量为0.86×107 cfu,平均插入片段长度大于1kb,文库质量较高。通过镉敏感酵母突变株Δycf1筛选烟草重金属镉胁迫相关基因,获得酵母单克隆70个。经分析可知,其涉及到谷胱甘肽转移酶、铜分子伴侣及甲硫蛋白等24个不同蛋白基因,初步鉴定为烟草应答重金属镉胁迫的候选基因。     

Gateway技术构建酵母双杂分析用辣椒cDNA文库

构建cDNA文库是利用酵母双杂交技术开展特定cDNA分离的重要基础工作.利用Gateway技术,在成功提取辣椒总RNA并分离mRNA的基础上,合成了3种读码框的双链cDNA,通过BP反应构建其相应的入门文库,再通过LR反应将cDNA迅速且定向地重组到酵母双杂分析用目的载体pDESTTM22上,构建成高质量目的文库.经检测入门文库和目的文库滴度均达到(4.0～5.0)×106 cfu/ mL,文库总容量为(2.4～3.0)×107 cfu,平均插入片段大小为1 250 bp,其质量完全满足于进一步利用酵母双杂体系分析目的基因互作蛋白cDNA.     

PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库的构建及鉴定

[目的]构建PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库,为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础.[方法]分离纯化PK15细胞mRNA,先后合成第一链和第二链cDNA,经平末端修饰后,定向导入EcoRⅠ和Hind Ⅲ接头,再由EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切消化,与噬菌体载体臂相连,然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装,形成初级cDNA T7噬菌体展示文库,并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量.[结果]经噬斑试验鉴定,初级文库滴度为2.0×105 PFU/mL,扩增后滴度达6.0× 1010 PFU/mL.PCR鉴定结果显示,文库的重组率为95.83%,且插入片段主要分布于500~2000 bp,其中500~750 bp的占21.73%,750~100 bp的占21.73%,1000~2000 bp的占39.13%.随机挑选20个克隆进行测序,发现均为猪源序列.[结论]构建的PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率,质量良好,符合后续文库筛选的要求,可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用.     

冬瓜均一化酵母双杂交 cDNA 文库的构建及鉴定

【目的】通过构建冬瓜酵母双杂交cDNA文库,为开展冬瓜基因功能研究提供技术支撑。【方法】以冬瓜高代自交系B227(冬瓜参考基因组测序材料)的根、茎、叶、雄花、嫩果等不同组织为材料,利用CTAB法提取RNA、分离纯化获得mRNA并进行双链cDNA合成和DSN均一化处理后,与pDONR222载体进行BP重组反应,转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建初级文库;提取初级文库质粒,与pGADT7-DEST载体通过LR重组反应,转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建酵母杂交cDNA次级文库。利用倍比稀释法计算文库库容量,并通过菌落PCR计算文库重组率和插入片段的大小。【结果】初级文库库容量为8.24×106 CFU,冬瓜均一化酵母双杂交次级cDNA文库库容量为1.03×107 CFU;次级文库中插入片段主要集中在850～3 000 bp,重组率为100%,具有良好的多态性。【结论】成功构建了冬瓜均一化酵母双杂交cDNA文库,文库完整性较高、质量较好,符合酵母双杂交实验要求,可应用于后续相关基因产物互作蛋白的筛选等试验,为冬瓜基因功能研究提供前提条件。     

甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库构建及评价

为了探索甘蓝胞质雄性不育的分子机制并研究花药发育相关重要基因编码蛋白质间的相互作用,采用SMART技术与同源重组方法,在酵母菌株Y187中构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。以甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)Ogura细胞质雄性可育保持系‘463’为试验材料,混合其不同生长时期的花蕾,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与线性载体质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母菌Y187中,二者利用酵母细胞内较高的同源重组酶活性,在酵母体内进行同源重组产生有复制活性的环形文库质粒,然后在缺亮氨酸(LEU)培养基板上筛选出所有克隆,成功构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。经检测,cDNA文库的转化率为1.20×108转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.85×109 pfu/mL,重组率大于95%。该文库容量为4.5×106cfu,理论上包含了甘蓝花蕾发育相关的所有基因。     

“Bolgogragsky”番茄cDNA文库的构建及质量评价

MYB102转录因子在番茄响应低温胁迫中起着重要作用,为了进一步探究番茄转录因子MYB102的分子作用机理,筛选其蛋白,以“Bolgogragsky”为材料,从番茄的根、茎、叶、花、果以及萼片组织中提取总RNA,以其为模板合成双链cDNA,纯化后与载体pGADT7-Rec共转化入酵母Y187感受态细胞中构建酵母双杂交cDNA文库。经测定,文库容量为2.31×10⁷ CFU,cDNA文库的转化效率为7.02×10⁶ CFU/μg,文库滴度为2.5×10⁸ CFU/mL,重组率为97%,插入的cDNA片段长度主要分布在250～2 000 bp。结果表明,构建的番茄cDNA文库符合酵母双杂交文库要求,可用于筛选MYB102的互作蛋白。     

大麦条纹花叶病毒诱导大麦cDNA文库的构建

构建病毒诱导的寄主植物cDNA文库是利用酵母双杂交方法筛选与病毒相互作用寄主因子的前提奈件.该文以大麦条纹花叶病毒接种大麦,在ELISA跟踪检测的病毒复制和运动初期,采集大麦叶片,用TRIZOL法提取总RNA,利用SMART原理进行反转录PCR获得dscDNA,Sfi I/Xho I共切后1.1%琼脂糖凝胶检测并分段回收dscDNA,分别与Sfi I/Xho I共切的载体连接后,共同转化X-blue感受态细胞构建文库.文库的容量和质量检测结果表明文库的容量为1.27×106,插入片段大于500 bp,集中在1.2 kb左右,符合酵母双杂交筛选文库的要求.     

外源ABA处理的玉米叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及评价

为深入研究ABA信号转导机制以及筛选该信号途径中相关重要蛋白的相互作用,利用Gateway技术,以外源ABA处理的玉米叶片为材料首先构建了cDNA初级文库,初级文库再通过LR重组的方式最终构建成以pDEST22为目的载体的酵母双杂交cDNA文库。经质量鉴定,该文库的滴度为3.9×106CFU/m L,文库总容量达到1.17×107CFU,平均插入cDNA片段长度大于800 bp,重组率大于95%。结果表明所获酵母双杂交文库质量较高,符合文库构建的标准,保证了文库的覆盖度,为进一步开展互作蛋白筛选的后续工作奠定了基础。