水稻抽穗期基因酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

为研究水稻开花调控的分子网络,构建了水稻品种中花11幼穗分化前倒二叶叶片的酵母双杂交cDNA文库。制备了高质量的总RNA,用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和Long Distance PCR合成双链cD-NA,通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株AH109中建立酵母双杂交所需的水稻倒二叶叶片cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的转化率为1.178×106/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.65×108 cfu/mL,重组率为94.7%,插入片段长度为350～2 000bp。该文库可用来筛选水稻抽穗期基因的互作蛋白。     

甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库构建及评价

为了探索甘蓝胞质雄性不育的分子机制并研究花药发育相关重要基因编码蛋白质间的相互作用,采用SMART技术与同源重组方法,在酵母菌株Y187中构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。以甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)Ogura细胞质雄性可育保持系‘463’为试验材料,混合其不同生长时期的花蕾,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与线性载体质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母菌Y187中,二者利用酵母细胞内较高的同源重组酶活性,在酵母体内进行同源重组产生有复制活性的环形文库质粒,然后在缺亮氨酸(LEU)培养基板上筛选出所有克隆,成功构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。经检测,cDNA文库的转化率为1.20×108转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.85×109 pfu/mL,重组率大于95%。该文库容量为4.5×106cfu,理论上包含了甘蓝花蕾发育相关的所有基因。     

南亚热带匍匐翦股颖草坪建植与管理技术

匍匐翦股颖为冷地型草坪草．Penncross及粤选1号新品系在南亚热带地区已成功栽培多年．本文介绍了匍匐翦股颖草坪建植与管理技术．认为匍匐翦股颖草坪在南亚热带地区能抵御夏季高温．     

全长cDNA文库的构建方法

全长cDNA文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径,克服了传统cDNA文库的缺点,节省了基因克隆和功能鉴定的时间,促进了功能基因组的研究进程。目前有6种构建全长cDNA文库的方法,包括Oligo-Capping、CAPture、SMART、CAP-trapper、CapSelect、CAP-jumping。这几种方法在起始材料用量、文库构建技术、实验操作复杂程度和文库构建质量等方面构存在不同程度的优缺点,但综合比较而言,SMART和CAP-trapper这两种方法比较有实际应用价值。SMART法适于简单、快速地构建一般质量的cDNA文库,如果采用Little-cycleSMART和Large-sizeSMART这两种改进技术,所建文库质量也非常好;CAP-trapper法虽然对实验技术要求较高,实验过程复杂,但所建文库全长率高,冗余性低,建库效率高,是目前构建高质量文库最好的方法。     

猪肾上皮细胞(PK-15)酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

应用SMART技术构建猪肾上皮细胞(PK-15)酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选与副猪嗜血杆菌(HPS)细胞致死膨胀毒素(CDT)不同亚基蛋白相互作用蛋白奠定基础。提取PK-15的总RNA,经LD-PCR合成双链cDNA,运用SMART技术,再通过同源重组的方法,构建了PK-15细胞的酵母cDNA文库。经检测,文库滴度达到了2.8×108CFU·mL-1,插入的双链cDNA片段范围为300～1 000 bp,片段平均大小为500 bp。此文库可用于筛选与HPS CDT不同亚基蛋白相互作用的蛋白,这将为治疗靶点的选择、基因缺失弱毒活疫苗的设计提供科学依据。     

三种草坪草种子对重金属镉·铅胁迫的反应

[目的]研究高羊茅、紫羊茅、匍匐翦股颖对重金属镉、铅胁迫的反应。[方法]以坪用高羊茅、紫羊茅、匍匐翦股颖为试验材料,研究重金属镉、铅胁迫对其种子萌发的影响。[结果]不同种子对重金属胁迫的响应不同,镉铅相比,铅对植物的抑制效应较大,匍匐翦股颖对2种重金属离子相对敏感,且浓度达300 mg/L时,种子几乎不发芽,即使发芽,质量较差;3种草籽相比,对镉、铅的耐受性大小分别为高羊茅>紫羊茅>匍匐剪股颖。[结论]该研究为重金属污染区坪用草种的生态适应性及抗逆性选育提供理论依据。     

利用SMART技术构建海带配子体cDNA文库

用Trizol试剂提取海带配子体总RNA,用SMART cDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库。经测定原始文库滴度达到1.1×108Pfu/ml,文库有500μl体积,库容量为5.5×107Pfu,通过PCR检测,文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.8~1.8 kb,平均插入片段长度约为1.34 kb。这些数据表明,已获得高质量的海带cDNA文库,为海带基因资源保存及新基因的克隆奠定了基础。     

不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库的构建及筛选

[目的]构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库,筛选与细胞色素C还原酶铁硫蛋白(BcRISP1)互作的蛋白.[方法]从不结球白菜Pol胞质雄性不育花中提取总RNA,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA).采用SMART建库技术构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花全长cDNA文库.利用BcRISP1基因的开放阅读框,构建诱饵表达载体pGBK T-7-BcRISP1转化AH109酵母菌,根据酵母双杂交技术筛选出与BcRISP1互作的片段,并进行质粒共转化验证.[结果]经检测,文库的转化率为每μg pGADT7-Rec 1.80× 106转化子,文库滴度为1.21×107 CFU·mL-1,重组率为94％,成功构建可以用于酵母双杂交的cDNA文库.酵母双杂交技术获得了与BcRISP1互作的阳性克隆,试验表明诱饵载体表达产物对酵母无毒性作用,质粒共转化试验初步验证了BcRISP1与CYP81G、PIP2蛋白的互作关系.[结论]cDNA文库的成功构建为后期互作蛋白的顺利筛选奠定了基础,利用酵母双杂交技术成功获得与BcRISPl互作的蛋白CYP81G和PIP2,为明确不结球白菜Pol胞质雄性不育相关基因的信号传递通路提供更多的依据,以期从分子水平上进一步阐明不结球白菜Pol胞质雄性不育的机制.     

高温对匍匐翦股颖果岭草坪草生理特性及再生性的影响

测定粤选1号匍匐翦股颖(AgrostisstoloniferaL.cv.YuexuanNo.1)和匍匐翦股颖品种Pen-ncross2年生果岭草坪草在38℃高温胁迫下叶片的一些生理指标和匍匐茎再生性。结果表明,高温胁迫下叶绿素和抗坏血酸含量下降,粤选1号叶绿素含量降幅低,抗坏血酸含量明显高于Penncross;丙二醛和脯氨酸含量增加,粤选1号丙二醛含量明显低于Penncross,而脯氨酸含量显著高于Pen-ncross。高温胁迫下粤选1号匍匐翦股颖保护酶(POD、SOD和CAT)活性明显高于Penncross。高温胁迫1-6d粤选1号匍匐翦股颖匍匐茎再生能力明显高于Penncross。     

干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库构建和鉴定

干旱胁迫作为番茄栽培生产过程中的不利因素之一,严重影响番茄生长发育、产量及品质。为完善"Micro-Tom"番茄在干旱胁迫下蛋白质互作机制,试验以"Micro-Tom"番茄品种为试验材料,采用Gateway技术构建干旱胁迫下"Micro-Tom"番茄酵母双杂交cDNA文库。酵母cDNA文库的文库滴度为6.0×10~7CFU·mL~(-1),插入cDNA片段平均长度1 kb,重组率为100%。结果表明,试验构建的干旱胁迫下"Micro-Tom"番茄酵母双杂交cDNA文库质量较高,完整度较好,可作为筛选互作蛋白的cDNA文库。     

PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定

[目的]构建PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库,为深入研究猪伪狂犬病病毒(PRV)与宿主细胞间的相互作用机制打下基础.[方法]提取PK-15细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA(ds cDNA),并对其进行均一化和SfiI酶切处理.处理后的ds cDNA分别连接3种阅读框pGADT7-SfiI载体,将连接产物转化至大肠杆菌BH5α构建三框cDNA初级文库,取三框cDNA初级文库进行混合扩增,通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集文库细菌提取文库质粒.[结果]3种读码框cDNA文库的库容量分别为3.0× 106、2.0× 106和2.0× 106 CFU,文库实际扩增基数>150万CFU;一号和三号读码框的基因重组率均为100%,二号读码框的基因重组率大于93%.cDNA文库外源基因插入片段长度在500~3000 bp.cDNA文库质粒浓度约1.0 mg/mL,质粒收获量约3.0 mg.[结论]构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库具有较高的重组率和库容量,符合酵母双杂交筛选要求,可用于研究PRV与PK-15细胞间的相互作用机制.     

二斑叶螨cDNA文库的构建及鉴定

为研究二斑叶螨发育相关基因的功能,利用TRIzol试剂提取二斑叶螨总RNA,通过SMART技术构建cDNA文库.利用SMART IVTM Oligonucleotide和CDSIII/3忆PCR Primer为引物,在反转录酶作用下,合成cDNA第1链,利用LD-PCR方法合成cDNA第2链。合成的双链cDNA经酶切回收后,再连接pDNR-LIB载体,转化大肠杆菌感受态细胞Trans5琢,检验库容量和重组效率,并采用PCR方法检测插入cDNA片段的大小.结果表明,构建的二斑叶螨cDNA文库的库容量为3.54C6 CFU/mL,重组效率达95.8%,插入片段长度在0.3~2.0 kb之间。构建的二斑叶螨cDNA文库质量良好袁能够为进一步研究二斑叶螨基因的功能奠定基础。     

索式桃花水母全长cDNA文库的构建

[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。     

杭州地区果岭草坪草匍匐翦股颖的越夏防护

匍匐翦股颖是高尔夫球场果岭的首选草种,属典型冷季型草坪草,在杭州地区栽植存在越夏困难的问题。通过增强抗性的一系列越夏防护措施,可避免形成病害发生和流行的环境条件,从而利于匍匐翦股颖的夏季生长。匍匐翦股颖;果岭草坪;越夏防护;杭州     

匍匐翦股颖粤选1号繁殖特性和草坪性状研究

通过对匍匐翦股颖粤选1号新品种的果岭性状及匍匐茎的繁殖性能进行试验研究，结果表明，粤选1号匍匐翦股颖所建果岭草坪的密度、盖度、色泽和质地等坪用性状均优于原品种Penncross．生物量也明显高于原品种Penncross，而春、秋季的垂直生长速度却显著低于Penncross：在高温的南亚热带夏季，采用原品种Penncross所建的草坪因受逆境胁迫，生长基本停滞，并明显发黄，而采用粤选1号匍匐翦股颖所建的果岭草坪却仍然具有良好的色泽效果。此外，粤选1号草坪草植株的蔓延速度虽然较慢，但较强的分蘖性能使得其仍然具有较快的成坪速度。通过营养繁殖建坪，匍匐茎上部成坪效果最好，是建植高尔夫果岭和高级园林绿化草坪等的优良草种。     

结缕草热激蛋白基因ZjHSP19.5植物表达载体构建及转化

以结缕草(Zoysia japonica Steud)cDNA为模板,利用PCR扩增ZjHSP19.5基因,并插入到PGEM-T Easy Vector上构建成克隆载体ZjHSP19.5-T。利用限制性内切酶BamHI分别对克隆载体ZjHSP19.5-T和植物表达载体PZH01进行单酶切,得到目的基因和线性质粒。在T4DNA连接酶的作用下将两者进行定向连接,经琼脂糖凝胶电泳检测、酶切鉴定,获得植物表达载体P-ZjHSP19.5。利用农杆菌介导法将重组植物表达载体P-ZjHSP19.5转化至匍匐翦股颖,为进一步研究ZjHSP19.5的功能和培育匍匐翦股颖抗热新品系打下基础。     

策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库

为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART (RNA 转录过程中的5′末端转换机制) 技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106 pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109 pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5～2.0 kb之间,平均长度为1.12 kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。      

利用烟草的cDNA酵母表达文库筛选镉胁迫相关基因

为了鉴定烟草在重金属镉胁迫处理下的功能基因,构建烟草cDNA酵母表达文库,并利用镉敏感的突变株对文库进行初步筛选。首先将烟草幼苗进行重金属胁迫处理,然后取幼根提取总RNA并纯化mRNA,采用SMART技术反转录成双链cDNA,将cDNA与入门载体pDONR222的同源重组区连接,再转到酵母表达载体pDEST22上,构建了Gateway技术兼容的酵母cDNA表达文库。经检测,构建的cDNA酵母表达文库滴度为4.32×106 cfu/mL,库容量为0.86×107 cfu,平均插入片段长度大于1kb,文库质量较高。通过镉敏感酵母突变株Δycf1筛选烟草重金属镉胁迫相关基因,获得酵母单克隆70个。经分析可知,其涉及到谷胱甘肽转移酶、铜分子伴侣及甲硫蛋白等24个不同蛋白基因,初步鉴定为烟草应答重金属镉胁迫的候选基因。     

春大豆花芽cDNA文库的构建及质量分析

【目的】为了解大豆多荚、多粒相关基因的调控机制,构建了大豆花芽cDNA文库,根据要求初步鉴定了所构建文库的质量.【方法】以大豆吉农18突变体的幼嫩花芽为材料提取总RNA,采用SMART技术合成双链cDNA.经蛋白酶K的消化及SfiⅠ酶切后,将所得cDNA克隆到λTriplEx质粒载体中,成功构建了大豆花芽全长cDNA文库.【结果和结论】将初始文库经扩增后保存,检测扩增文库滴度为2.13×108pfu/mL,重组率接近95.3%,菌落PCR鉴定插入片段主要分布在0.5~2.0 kb.插入片段平均大小在1.0 kb左右.表明本研究所构建的文库既满足了目的基因的分离筛选,又可保证全长cDNA文库的获得,该文库的构建为进一步开展相关基因的克隆及分子生物学研究奠定基础.     

SMART策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库

为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART(RNA转录过程中的5′末端转换机制)技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5～2.0kb之间,平均长度为1.12kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。