不同ELISA检测方法在检测出壳雏鸡禽白血病病毒感染中的应用

通过雏鸡胎粪中群特异性衣壳蛋白27(p27)抗原检测以判定禽白血病病毒(ALV)垂直传播是实施禽白血病净化的关键步骤,为对比不同ALV-p27抗原ELISA试剂盒对我国四类广泛流行的亚群ALV垂直传播的检测效果,本试验设置ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K感染组,以无菌生理盐水作为对照组,在8胚龄时以卵黄囊接种的方式感染SPF鸡胚,建立鸡胚携带ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的垂直感染模型。采集各组雏鸡胎粪样品和血浆样品,死亡鸡胚肝脏样品,死亡雏鸡胎粪样品、血浆样品和肝脏样品,其中血浆和肝脏样品需接种鸡胚成纤维细胞系(DF-1细胞)进行病毒分离,各样品以4家公司提供的ALV-p27抗原ELISA试剂盒进行检测,并以实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行平行检测,比较阳性检出率和灵敏度。结果显示,4家公司的ALV-p27抗原ELISA试剂盒对于同一样品的阴阳性判定结果基本一致,但灵敏度存在差异;胎粪样品直接ELISA检测不能将ALV阳性鸡只全部检出,相对于胎粪样品,血浆和肝脏病毒分离样品ELISA检测更具有灵敏度优势。本试验所建立的对比方法不仅有助于评估4家公...     

禽B型白血病病毒的分离及分子分型鉴定

从送检的骨石症蛋用种鸡中分离出一株禽白血病病毒(ALV)。剖检骨石症发病鸡,采集病变的肝脏、脾脏组织,提取病毒基因组,并利用针对ALV群特异性抗原P27基因设计的引物进行PCR快速检测确定为ALV感染。将病变组织接种SPF鸡胚绒毛尿囊膜,连续传代3次。进一步针对亚群间特异性抗原gp85区设计一对引物进行PCR扩增并酶切分析。结果确认分离到的1株病毒为ALV-B亚型。     

广西地方土鸡马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒混合感染的报告

广西南宁某养殖场的广西土鸡群在60日龄开始陆续出现发病、死亡,105日龄送检时累计发病率20%,死亡200多只。通过病理组织学观察、PCR鉴定及病毒基因序列测定,证明土鸡群中存在马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒的混合感染。     

K亚群禽白血病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据K亚群禽白血病病毒(ALV-K)gp85基因序列设计1对引物,对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ALV-K的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法在1～10~7 copies/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度达到1 copies/μL,是常规PCR方法的100倍。该方法与经典亚群ALV及其他常见禽免疫抑制病病毒无交叉反应,批间与批内重复性试验变异系数均小于2%。将ALV-K原型株JS11C1通过卵黄囊接种途径感染SPF鸡,运用本试验建立的实时荧光定量PCR方法,对感染鸡体内各器官的病毒分布及病毒载量进行了检测。结果显示,在感染鸡的心脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官中均可检测到病毒,其载量无明显差异。结果表明,本试验所建立的实时荧光定量PCR方法具有敏感度高、特异性强和重复性好的优点,可用于ALV-K的快速、定量检测,该方法同时为ALV-K致病机制的研究提供了良好的技术手段。     

禽白血病的PCR检测

试验根据禽白血病病毒群特异性抗原P27基因合成引物,经PCR反应条件的优化,针对来源于不同养殖场病料样本的P27基因进行PCR扩增,结果ALV–J抗体阳性鸡血液样本、ALV–J抗体阴性鸡血液样本、疑似病例肝脏和正常鸡肝脏中的病原核酸检出率分别为50.0%、0、90.0%和61.5%.同时将扩增的目的基因进行克隆测序,并与GenBank中的参考毒株进行比较,结果表明目的基因片段序列长793 bp,与参考毒株核苷酸序列同源性分别为99.2%、97.6%.     

禽白血病病毒在惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡的垂直传播特性分析

旨在探明禽白血病病毒(ALV)在地方鸡种惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡的垂直传播特性。以惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡为素材,43周龄时进行血液与精液ALV病毒分离检测,结合系谱追溯筛选个体组建两个大试验组:阳性惠阳胡须鸡♂×阴性汶上芦花鸡♀;阴性汶上芦花鸡♂×阳性惠阳胡须鸡♀。后代群体隔离饲养,进行1日龄胎粪p27抗原、42日龄泄殖腔拭子p27抗原和病毒分离检测,并对ALV分离检测阳性样本进行PCR扩增、测序和遗传演化分析确定ALV的亚型。结果表明,阳性公鸡后代胎粪p27抗原、泄殖腔拭子p27抗原和血浆病毒分离阳性率显著高于阳性母鸡后代(P0.05),阳性公、母鸡后代病毒分离阳性率分别为8.54%和0%;阳性公、母鸡S/P值高低与其后代的p27抗原阳性率没有显著相关性(P0.05);胎粪和棉拭子p27抗原的假阳性率较高,且与病毒分离相比,胎粪p27抗原检测的漏检率为15%;序列分析和遗传演化分析结果表明病毒分离检测阳性个体均为ALV-J。公鸡在地方鸡种惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡ALV垂直传播中发挥重要作用,在禽白血病净化过程中要加强对于公鸡感染的监测。     

禽白血病病毒分离鉴定

使用 SPF鸡胚成纤维细胞从蛋用种鸡的病料中分离到一株病毒.经禽白血病病毒（ALV） p-27抗原ELISA检测、病毒培养、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）鉴定、群特异性抗血清中和试验和动物回归试验等证明,该株病毒属于禽白血病病毒.     

PCR检测血液样品方法在禽白血病净化中的应用研究

本研究选择山东某地方品种祖代种公鸡的177份血液样品和177份泄殖腔棉拭子样品为试验材料,应用ELISA、病毒分离、PCR等方法对禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27抗原进行检测。结果显示,血清、泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原阳性率分别为20.34%(36/177)、26.55%(47/177);病毒分离率为1.70%(3/177),血液样品PCR方法检出J亚群ALV(ALV-J)阳性率为0.56%(1/177),序列分析结果显示为ALV-J,但该血液样品的病毒分离结果为阴性。研究表明,PCR检测血液样品方法的应用有助于减少禽白血病净化所需的病毒分离结果的可能缺漏。在此基础上,优化并进一步拓展对其他亚群ALV的PCR方法检测,可作为禽白血病经典净化方法的有力补充,并加快我国地方品种鸡禽白血病的净化进程。     

禽白血病病毒斑点杂交检测方法的建立

为建立禽白血病病毒(ALV)斑点杂交检测方法,本研究采用RT-PCR技术扩增ALV群特异性p27抗原基因的部分片段,并以纯化的p27PCR产物为模板,合成地高辛标记探针,以此建立了ALV的斑点杂交检测方法。用该方法对4份疑似感染ALV的现地病鸡组织样品和18枚鸡胚进行检测,结果表明所有样品均为阳性,而且与PCR检测结果的符合率达到100%。该方法具有良好的特异性和敏感性,适应于ALV临床大规模检测。     

基于Multi-PCR的淮南王土鸡J亚群禽白血病诊断及病原鉴定

为确诊疑似J亚群禽白血病病例,试验从湖北某养殖户送检的散养淮南王土鸡典型病变组织中,提取DNA,用分别针对A、B、J亚群禽白血病病毒(ALV)和针对马立克氏病病毒(MDV)、网状内皮增生症病毒(REV)的Multi-PCR方法进行检测,结果只扩增出与ALV-J对应的条带,而无MDV、REV、ALV-A、ALV-B对应条带,表明鸡群感染ALV-J。用DF-1细胞进行病毒分离培养,以抗ALV-J的单克隆抗体JE9为一抗进行间接免疫荧光试验结果显示DF-1细胞呈现亮绿荧光,表明从病料中分离到的病毒为ALV-J,这也是首次从淮南王土鸡分离到ALV-J。     

ALV-A诱发蛋鸡髓细胞瘤和淋巴瘤混合型禽白血病自然病例初报

湖北某蛋鸡场发生肿瘤性疾病,剖检可见病鸡肝、肾、脾肿大,肝脏表面有大小不等的灰白色结节,其中2只(2/7)病鸡肠系膜明显增厚并布满大量灰白色结节。取病变组织制备石蜡切片,HE染色,部分病鸡(4/7)可见髓细胞瘤及淋巴细胞瘤。采集病变组织进一步进行PCR、病毒分离和IFA等实验室检测,结果病料组织DNA中仅检测出A亚群禽白血病病毒(ALV-A)核酸序列,未检测出其他亚群ALV;用病料制备组织悬液接种的DF-1细胞,IFA呈ALV-A阳性、ALV-J阴性。将分离的病毒静脉接种无外源性ALV感染的13日胚龄蛋鸡鸡胚,可复制出与自然病例类似的肿瘤。结果表明,分离的病毒为ALV-A,病鸡确诊为由ALV-A引起的髓细胞瘤和淋巴细胞瘤混合型禽白血病。这是在国内首次发现ALV-A诱发蛋鸡髓细胞瘤和淋巴瘤混合型禽白血病的自然病例。     

J亚型禽白血病病毒的分离与鉴定

本研究分别从广西的地方肉鸡及河北、辽宁的蛋鸡中分离到了3株禽白血病病毒.剖检疑似发病鸡只.采集病变的肝脏、脾脏组织,经过RT-PCR检测确定为ALV感染.将病变组织接种CEF细胞,连续传代2次,将细胞上清接种DF-1细胞,p27抗原检测为阳性.同时提取病毒基因组,用H5/ADI和H5/H7两对特异性引物进行PCR扩增,结果3株为ALV-J亚型.进一步设计ALV-J亚型gp85特异性引物进行PCR扩增并测序.结果确认分离到的3株病毒为ALV-J亚型.其gp85序列与标准毒株HPRS-103同源性为96%.同时,用p27单抗进行间接免疫荧光试验,测定毒力.综上所述,我们从广西地方肉鸡巾分离到1株J亚型禽白血病病毒,从河北及辽宁的蛋鸡中分离到2株J亚型禽白血病病毒.     

广西黑土鸡种群禽白血病净化防控效果研究

研究分别对广西两家育种公司DGGX4和DGGX 11的黑土鸡育种群开展了禽白血病的净化,应用商品化的禽白血病病毒p27抗原、亚型A/B和J的抗体共3种ELISA检测试剂盒,分别对公鸡的肛拭或病毒细胞培养物、母鸡种蛋的蛋清以及血清样品进行检测.然后根据肛拭、病毒细胞培养物或者蛋清p27抗原检测的结果淘汰阳性鸡,阴性的留种,抽检血清样品抗体阳性的鸡也淘汰,同时对种蛋、鸡雏、后备鸡、繁殖群实施严格的生物安全措施.结果显示,DGGX4公司经过4个世代的净化,种群p27抗原的阳性率由零世代的12.4％下降到三世代的3.30％; DGGX 11公司经过5个世代的净化,种群p27抗原的阳性率由零世代的7.71％下降到四世代的1.46％.结果提示禽白血病净化效果显著,证明所采取的净化方案可行.     

蛋清样品用于禽白血病病毒分离的效果评估

为评估蛋清样品在禽白血病病毒(ALV)分离中的作用,从广东某地方鸡种群采集种蛋1673个,经ALV p27抗原ELISA检测,将阳性蛋清分为5个不同S/P值区间(A≥2.0,1.5≤B2.0,1.0≤C1.5,0.5≤D1.0,0.2≤E0.5)并设立对照区间(F0.2),分别同时接种DF-1细胞和CEF细胞进行病毒分离,通过PCR方法对其中20份DF-1细胞培养物p27抗原阳性样品进行亚群鉴定。从送检种蛋蛋清共检出ALVp27阳性样品107份,阳性率为6.4%(107/1673);不同S/P值区间蛋清病毒分离情况分别为:A区间CEF和DF-1细胞病毒分离率均为100%(27/27);B区间为80%(16/20,CEF)和75%(15/20,DF-1细胞);C区间为55.6%(10/18,CEF)和33.3%(6/18,DF-1细胞);D区间为36.4%(8/22,CEF)和9.1%(2/22,DF-1细胞);E区间为5%(1/20,CEF)和0%(0/20,DF-1细胞);对照组F区间为8.3%(1/12,CEF)和0%(0/12,DF-1细胞)。PCR结果显示,20份样品中均有ALV-J感染,其中6份为ALV AJ共感染。结果表明从蛋清样品可以分离出外源性和内源性ALV;从ALVp27抗原ELISA高S/P值的蛋清易分离出外源性ALV;低S/P值的阳性蛋清样品很可能是由内源性ALV引起,这给临床上禽白血病的净化检测造成一定的"误诊";该地方鸡种群不仅存在至少两个亚群外源性ALV,也有内源性ALV。     

一株新亚群禽白血病病毒全基因组序列分析

为了解外源性禽白血病病毒(ALV)在山东省部分地区肉鸡中的流行状况,采集无菌抗凝血分离血浆接种DF-1细胞、ELISA p27抗原检测以及DNA提取进行PCR扩增等方法,从山东省某地区大型养殖场不同个体养殖场出栏肉鸡群中分离鉴定出1株ALV,命名为FC1505。分析其囊膜糖蛋白gp85氨基酸序列与近年来从地方品种鸡中疑似新亚群ALV-K分离株的相似性最高,相似性均在95%以上,而与其他已知亚群ALV的相似性均低于90%。为了进一步分析该分离株分子特性,对其进行全基因组测序,并与已知亚群ALV分离株序列进行比较。结果表明,FC1505分离株整个基因组中gag、pol和gp37基因相对保守,与ALV参考毒株序列相似性都在90%以上,但均与疑似K亚群的ALV分离株相似性最高;全基因组序列分析进一步说明FC1505属于ALV-K。本研究继我国江苏省和华南地区K亚群ALV报道后,首次从山东地区肉鸡中鉴定到一株ALV-K并完成其全基因组序列分析。     

进口白羽肉种鸡禽白血病疫情鉴定

2018年以来,某进口品种肉种鸡发生疑似禽白血病病例,流行范围广,危害严重,为确定该次疫情的病原,本研究从辽宁、山东等地发病鸡场采集55份疑似禽白血病病料样品。病理组织切片观察显示,病料样品肝脏和脾脏均有髓细胞样肿瘤细胞增生。针对禽白血病病毒(ALV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮组织增生症病毒(REV)的特异性PCR检测结果显示,55份病料样品中ALV阳性样品12份(21.8%),MDV阳性样品1份(1.82%),REV均为阴性。将12份ALV阳性病料样品经处理后接种DF-1细胞进行病毒分离,ELISA检测结果显示有8份ALV群特异性抗原阳性。ALV多重PCR检测结果表明,8个分离株均为J亚群ALV(ALV-J),测序结果显示,8个分离株之间核苷酸序列同源性为99.5%~100%,与A、B、C、D、E亚群ALV的同源性仅为56.5%~58.8%,与ALV-J的同源性为90.7%~96.6%,进一步表明所有分离株均为ALV-J。上述结果表明,引起该次进口白羽父母代肉种鸡发生禽白血病的病原主要以ALV-J为主,该研究结果为疫情的溯源和有效防控奠定了基础。     

clade 1.3 J亚群禽白血病病毒与Ⅱ型禽网状内皮组织增殖病病毒共感染的病原分离鉴定及其囊膜基因分析

为了解已经开展禽白血病净化的广西地方鸡种瑶鸡中禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）与禽网状内皮组织增殖病病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）的感染情况，试验对鸡血浆样品接种的细胞培养物分别进行ALV群特异性抗原P27的ELISA检测和亚群特异性PCR鉴定，以及REV PCR鉴定。结果显示：一份样品为ALV-J和REV的混合感染，其中ALV-J命名为GX20YLJ1,REV命名为GX20YLR1；遗传进化分析显示，分离株GX20YLJ1和GX20YLR1分别属于clade 1.3的ALV-J和罕见的Ⅱ型REV;GX20YLJ1 gp37和GX20YLR1gp20亚单位的二级结构功能区由α-Helix组成，而GX20YLJ1 gp85和GX20YLR1 gp90亚单位的二级结构具有多样性；分离株GX20YLR1的gp90与美国REVⅡ型分离株SNV的gp90亚单位的二级结构最相似，与核苷酸序列分析的进化树结果一致。结果表明，广西地方品种净化鸡群仍存在clade 1.3的ALV-J，并首次发现与Ⅱ型REV的混合感染，提示在净化检测...     

散养淮南王土鸡J亚群禽白血病的诊断

对湖北省某农户散养的12周龄淮南王土鸡病鸡进行剖检,发现病鸡肝脏有白色肿瘤;心肌增厚,有疑似肿瘤赘生物;脾脏萎缩,切面呈暗色。用J亚群禽白血病病毒（ALV-J）特异性引物进行PCR检测,扩增出了约545 bp的条带,病鸡组织内含有ALV-J病毒核酸序列,表明该病例为ALV-J感染。     

三黄鸡临床血管瘤病例中分离出A亚群与J亚群禽白血病病毒

为了解禽白血病病毒在广西鸡群中流行情况,采用DF-1细胞接种、细胞培养上清p27抗原检测、PCR扩增,对临床血管瘤型禽白血病的三黄鸡病料进行了病毒分离,并对分离病毒gp85基因进行测序和序列比较。结果表明,从1只病鸡同时分离到了一株A亚群禽白血病病毒(ALV-A)与一株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),分别命名为HG01-A株和HG01-J株。ALV-A gp85与7株A亚群氨基酸同源性为85.8%~87.5%,与A亚群美国株MQNCSU同源性最高为87.5%,与A亚群原型株RSA同源性为86.9%。而ALV-J gp85与7株毒株核酸序列同源性为84.0%~93.8%,与广东株XX2-08以及四川株SCSM01同源性最高为93.8%,与英国原型株HPRS103同源性为90.2%。进化分析进一步表明,HG01-A与各参考株亲缘关系较远,HG01-J与SCSM01亲缘关系最近。本研究首次从同一只广西三黄鸡中同时分离到ALV-A及ALV-J,进一步完善了我国地方品种鸡群中禽白血病的流行病学信息。     

麻黄鸡核心育种群中不同禽白血病检测方法的效果比较分析

禽白血病(Avian leukosis,AL)给我国肉鸡产业带来了严重危害,作为我国重要的地方优质鸡品种之一的麻黄鸡也深受其害,本试验采用病毒分离、IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒、禽白血病快速检测试纸条等方法对广东某鸡场麻黄鸡核心育种群进行禽白血病净化工作,经过3个世代的净化,种公鸡的禽白血病P27抗原阳性率下降明显,但雏鸡的净化整体来看效果不佳。经分析表明,禽白血病快速检测试纸条产品质量稳定性不好,导致检测结果不可靠,用病毒分离和IDEXX试剂盒检测到的阳性率比较一致且稳定。