类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体B亚单位基因的表达与鉴定

将由 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增并克隆在ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中的ｓｌｔⅡｅ Ｂ基因切出,并按预定的阅读框架插入表达性质粒载体 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ６ｐ１ 中的谷胱苷肽转移酶（ Ｇ Ｓ Ｔ）基因的下游。重组质粒 ｐｐｐｓｌｔⅡｅ Ｂ在大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１ 中以融合蛋白的形式表达 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ蛋白（命名为 Ｇ Ｓ Ｔ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ）,即 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ蛋白（７５６８ｋ Ｄ）与谷胱苷肽转移酶（２７３３５ｋ Ｄ）相连组成分子量为 ３４８８５ｋ Ｄ 的融合蛋白。通过对重组大肠杆菌 Ｐ Ｐ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ的菌体裂解物的 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳分析,以及根据抗原抗体结合反应的免疫学特性,通过 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 鉴定,重组大肠杆菌 Ｐ Ｐ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ（含有重组质粒 ｐｐｓｌｔⅡｅ Ｂ的大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１）可以大量表达融合蛋白形式的 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ。根据 Ｇ Ｓ Ｔ 可与其底物谷胱苷肽结合的特性,用谷胱苷肽结合的 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ制备的亲和凝胶纯化表达产物,纯化的表达产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ,可以鉴定到分子量约为 ３５ｋ Ｄ 的蛋白条带,这与融合蛋白形式的 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ分子量（３４８８５ｋ Ｄ）相当。     

弓形虫主要表面抗原P30基因克隆与表达

将液氮保存的弓形虫 Ｎ Ｔ 株经小鼠复壮后，取腹腔液提取弓形虫基因组 Ｄ Ｎ Ａ，采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法从弓形虫 Ｎ Ｔ 株中扩增出约 ８００ ｂｐ 的片段。产物经 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ和 Ｘｂａ Ｉ酶切后，克隆到 ｐ Ｕ Ｃ１９ 载体中，构建了 ｐ Ｂ Ｖ Ｐ３０ 非融合表达质粒和 ｐ Ｅ Ｔ Ｐ３０ 融合表达质粒。ｐ Ｂ Ｖ Ｐ３０ 转化到宿主菌 Ｄ Ｈ５α、ｐ Ｅ Ｔ Ｐ３０ 转化到宿主菌 Ｂ Ｌ２１ （ Ｄ Ｅ３）后，分别经温控诱导和 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导，产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分析，ｐ Ｂ Ｖ Ｐ３０ 未发现表达产物，ｐ Ｅ Ｔ Ｐ３０ 出现约 ３０ ０００ 的产物。 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 显示，该蛋白与兔抗弓形虫血清发生特异性反应；薄层扫描显示，该蛋白占菌体总蛋白的 ２０％ 以上。     

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚单位基因的克隆与表达

为防治绿脓杆菌感染造成的细胞坏死及多器官衰竭，本试验克隆了含绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）结合亚单位（Ⅰ区）和部分跨膜亚单位（Ⅱ区）编码３０９个氨基酸的约１０００ｂｐ的基因片段，以正确阅读框架将该片段置于原核高效表达Ｔ７启动子下游，构建了高效表达质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ。转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭ１７４（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ后，经ＩＰＴＧ诱导４ｈ，均表达了外源目的基因蛋白，其中ＢＬ２１（ＤＥ３）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ的表达量明显高于其他宿主菌。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，外源蛋白分子量约３４０００，与ＰＥＡⅠ区和部分Ⅱ区基因所编码的蛋白理论估计值相符，命名为ＰＥ３４。凝胶薄层扫描显示，ＰＥ３４含量占菌体蛋白总量的５６％。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ检测证明ＰＥ３４为所需目的蛋白     

狂犬病病毒糖蛋白基因在原核细胞中的表达

将狂犬病病毒糖蛋白（ＲＶｇｐ）基因ＢｇｌⅡ片段（１６７５ｂｐ）分别正向插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－１７ｂ和ｐＥＴ－１７ｂ２（用ＳａｃⅠ－ＮｄｅⅠ缺失掉ｐＥＴ－１７ｂ６０ｂｐ含起始密码子ＡＴＧ小片段）的ＢａｍＨⅠ切点，构建重组质粒ｐＥＴ－１７ｂＲＶｇｐ和ｐＥＴ－１７ｂ２ＲＶｇｐ。将其分别转化表达受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）和Ｅ，ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ．ＩＰＴＧ诱导表达，菌体经超声波裂解处理后ＳＤＳ－ｐＡＧＥ，染色，在分子量约６００００处可见重组质粒表达的较宽的蛋白带，以抗ＲＶｇｐＭｃＡｂ进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，表明该表达蛋白为ＲＶｇｐ。通过扫描显示，表达的ＲＶｇｐ占菌体总蛋白的１０％～１４％，其中ｐＥＴ－１７ｂ２ＲＶｇｐ在Ｅ。ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中的表达量最高。     

表达大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合蛋白双价基因工程菌株的构建

重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ,而且已失去天然ＳＴ１肠毒素生物毒性。用从ＩＰＴＧ 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＭＬＤ 的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋ ,ＬＴ＋ ）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株     

含绿脓杆菌外毒素A受体结合区重组蛋白的纯化

将表达含绿脓杆菌外毒素（ＰＥＡ）受体结合区基因的质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,经ＩＰＴＧ诱导表达了含ＰＥＡ受体结合区的重组蛋白（称ＰＥ３４）。ＰＥ３４主要以包涵体形式存在于大肠杆菌中,用溶菌酶－脱氧胆酸钠法结合超声波裂解法破碎细菌,离心制备包涵体。用２ｍｏｌ／Ｌ脲洗涤包涵体后,包涵体纯度可达７５％,在８ｍｏｌ／Ｌ脲存在条件下,ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶滤过,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析纯化,获得ＳＤＳ－ＰＡＧＥ１条带的ＰＥ３４,纯度达９５．８％,得率为２４．５％。     

重组马传染性贫血病病毒核心蛋白抗原在 A GID 和ELISA中应用的评价

用昆虫杆状病毒表达系统获得的马传染性贫血病病毒（ Ｅ Ｉ Ａ Ｖ） 核心蛋白（ Ｇａｇ） 和 Ｐ２６ 蛋白, 作为免疫琼脂双扩散（ Ａ Ｇ Ｉ Ｄ） 和酶联免疫吸附试验（ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ） 抗原。对７６ 份已知马传贫非特异性血清进行检查, 同时与市售 Ａ Ｇ Ｉ Ｄ 和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 试剂盒作比较。证明, 用表达蛋白作抗原的 Ａ Ｇ Ｉ Ｄ 和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测结果均为阴性反应, 而用市售 Ａ Ｇ Ｉ Ｄ 试剂盒检查有５４ 份马血清出现非特异性反应, 市售 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 试剂盒检查也出现了非特异性反应, Ｏ Ｄ 值比表达抗原 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 高３５ 倍。初步证明在 Ａ Ｇ Ｉ Ｄ 和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 法中, 表达抗原优于常规马传贫病毒抗原。     

大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１,回收０８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因,再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒ｐＸＥＴＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３２１％,而且无天然ＳＴ１生物毒性。     

由表达嵌合IBDV结构蛋白的重组杆状病毒诱导的主动交…

编码在ＩＢＤＶ变异株ＧＬＳ大基因组片段Ａ的ＶＰ２结构基因经过修饰后，编译出只在ＩＢＤＶ标准株才能见到的中和表位，编码有ＶＰ３，ＶＰ４的大片段Ａ的一个嵌合ｃＤＮＡ克隆和修饰过的变异ＩＢＤＶＶＰ２结构蛋白在一重组杆状病毒中得到表达。用一组中和单抗（ＭＡｂ）对表达的嵌合蛋白评价后指出，此嵌合蛋白不仅含有以前用ＭＡｂ鉴定过的所有ＧＬＳ变异株表位，而且还含有只有标准株才见到的Ｂ５９中和表位，这种亚单位疫苗对     

绿脓杆菌外毒素A recA基因的融合及融合蛋白的表达

将绿脓杆菌ｒｅｃＡ基因克隆到ｐＵＣ１８中，构建了中间载体ｐＵＣＲ１８；然后以正确的向位及阅读框架将ｒｅｃＡ基因亚克隆到毒性基因缺失的绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）基因中，构建了ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因质粒ｐＥＲＡ；融合基因经ＢａｍＨＩ及ＥｃｏＲＩ酶切，以正确阅读框架插入带有Ｔ７表达启动子的质粒ｐＥＴ－１７ｂ，构建了可表达ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因的质粒ｐＥＲＡ－１７ｂ。经酶切分析及ＰＣＲ扩增检测证明，绿脓杆菌ｒｅｃＡ已插入ＰＥＡ毒性基因中。ｐＥＲＡ－１７ｂ转化到ＤＥ３溶原态大肠杆菌ＨＭＳ１７４中，经ＩＰＴＧ诱导，表达了ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和凝胶薄层扫描ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白，表明ＰＥＡ－ＲｅｃＡ的分子量约为９００００，与理论推算相符，表达率占菌体总蛋白量３．４２９％，用ＰＥＡ抗血清和抗ＲｅｃＡ单克隆抗体作免疫印迹分析，ＰＥＡ－ＲｅｃＡ与它们都有免疫学反应     

猪腺病毒3型Protease蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗体制备

试验旨在研究猪腺病毒3型（PADV3） Protease蛋白在大肠杆菌中的表达,并制备该蛋白的多克隆抗体。利用PCR扩增PADV3 Protease基因,构建重组原核表达载体pET28a-PADV3-Protease和真核表达载体pEGFP-PADV3-Protease,采用双酶切和测序鉴定;将原核表达载体pET28a-PADV3-Protease转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞得到重组原核表达菌株,经IPTG诱导收集蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定,将目的蛋白纯化后与佐剂乳化制备免疫原免疫家兔,制备Protease蛋白多克隆抗体;将真核表达载体pEGFP-PADV3-Protease转染HEK293细胞经G418筛选建立稳定表达EGFP-Protease融合蛋白的细胞系,以该稳定表达细胞系为包被抗原,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）检测抗体的免疫活性与抗体滴度。结果显示,Protease基因开放阅读框（ORF）为615 bp,原核表达系统中Protease蛋白以包涵体形式存在,分子质量大小为23 ku,与真核细胞表达的Protease蛋白分子质量一致,该蛋白在细胞核与细胞质中均有分布,制备的Protease蛋白多克隆抗体能与EGFP-Protease融合蛋白稳定表达真核细胞系发生特异性的反应,与对照细胞无反应。本试验构建了Protease蛋白原核表达菌株和真核表达细胞株,制备的PADV3-Protease蛋白多克隆抗体免疫活性良好,为进一步研究Protease蛋白的生物学功能和PADV3的血清学诊断提供了基础材料。     

家蚕BmE(spl)-like基因的克隆与表达谱分析

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条新的cDNA序列,生物信息学分析发现其编码的蛋白质序列与果蝇Enhancer of split基因[E(spl)]编码的DNA结合转录调控因子bHLH(helix-loop-helix)有较高的同源性,将该基因命名为BmE(spl)-like(Bombyx mori Enhancer of split like)。该基因的ORF长606 bp,编码201个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量22.3 kD,等电点9.7。构建重组表达质粒pET-28a-BmE(spl)-like并在E.coli BL21(DE3)菌株中表达BmE(spl)-like蛋白,经亲和层析和FPLC反向柱纯化融合蛋白His-BmE(spl)-like并制备了抗体效价1∶25 600以上的多克隆抗体。用qRT-PCR方法检测BmE(spl)-like在家蚕成虫发育期的转录水平最高,结合果蝇同源基因的功能,推测该基因与蚕蛾的翅发育相关;该基因在家蚕5龄幼虫各组织中的转录水平以表皮最高,马氏管中最低。Western blotting检测BmE(spl)-like在家蚕5龄幼虫性腺中的表达水平最高,其次是丝腺、表皮、脂肪体、肠组织,在头部、马氏管和气管中的表达水平极低,与qRT-PCR检测的BmE(spl)-like在各组织中的转录水平有些差异。     

鸡艾美耳球虫3-1E基因的克隆与表达

应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)技术 ,分别从柔嫩艾美耳球虫甘肃株 (E.tenella GS,Et GS)和堆型艾美耳球虫青海株 (E.acervulina QH,Ea QH)孢子化卵囊子孢子中提取的总 RNA扩增得到鸡球虫子孢子表面抗原 3- 1E基因 (Et GS3-1E和 Ea QH 3- 1E)。将 Et GS3- 1E与原核表达载体 p GEX- 6 P1连接 ,构建了的 p GEX- 3- 1E原核表达质粒 ,并获得融合蛋白的高效表达和纯化。序列分析表明 :Et GS3- 1E和 Ea QH 3- 1E的 ORF均为 5 13个碱基 ,共编码 171个氨基酸。Et GS3- 1E的蛋白分子量为 18.5 k D,Ea QH 3- 1E的蛋白分子量为 18.6 k D。ORF比较 ,Et GS3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 2个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.8%,有 1个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 99.4 %;Ea QH 3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 4个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 97.7%,有 3个氨基酸变异 ,氨基酸同源性为 98.3%;Et GS 3- 1E与 Ea QH 3- 1E比较 ,有 3个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.2 %,有 2个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 98.8%。获得了 Et GS 3- 1E融合蛋白的高效表达和纯化 ,表达率达 4 3.2 %。     

基因分析实现CAV VP1基因在大肠杆菌中的高效表达

通过分子生物学软件DNASTAR对CAV VP1的基因分析发现,CAV VP1基因的5端非抗原区编码蛋白的密码子中存在连续的大肠杆菌稀有密码子。为了在大肠杆菌中高效表达CAV VP1,文章研究扩增了不含5’端稀有密码子的CAV VP1基因,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组表达载体pGEX-VP1,成功进行了高效表达。电泳条带分析表明,融合蛋白的表达量在44%左右,为研究CAV VP1的抗原性提供了丰富的来源。     

抗蓖麻毒素单链抗体基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

为构建和表达抗RT单链抗体(ScFv)蛋白,用RT-PCR方法从能分泌特异性抗RT单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗RT-ScFv基因。将ScFv基因连接到pMAL-p2X表达载体,转化TB1表达菌。阳性克隆用IPTG诱导18h,Western blotting鉴定重组蛋白。结果表明,试验成功扩增出了ScFv基因,长度约为750bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(Gly4Ser)3-VH。其VH全长363bp,可编码121个氨基酸,VL全长324bp,可编码108个氨基酸。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,抗RT-ScFv在TB1表达菌中获得高效表达,pMAL-p2X表达的ScFv加上同时融合表达的MBP标签分子质量约为75ku。本试验成功构建了pMAL-RT-ScFv表达载体,并获得了高效表达。     

荣昌猪白细胞介素-2受体γ链基因克隆、表达与鉴定

运用RT-PCR技术从由刀豆蛋白(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)扩增出猪白细胞介素-2受体γ链基因的完整开放阅读框(ORF),长约1 107 bp,编码由368个氨基酸残基组成的相对分子质量为41 780的蛋白多肽.荣昌猪IL-2Rγ与人、猕猴、牛、犬、鼠在氨基酸水平上的同源性分别为81.6%,80.8%,85.1%,83.2%和68.8%.运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rγ,开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因,共1 020 bp.将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)后在E.coli BL21中诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为52 000,重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占茵体总蛋白的37.6%;Western-blotting分析表明,在相对分子质量52 000处有一奈特异性的带;对γ诱导重组茵进行转录检测得到约1 020 bp的特异性片段.     

家蚕膜蛋白基因(BmTmC27)的序列分析及组织特异性和原核表达

从家蚕蛹cDNA文库中筛选获得一条家蚕膜蛋白基因序列,通过编码氨基酸序列的同源性比对表明其可能是家蚕的未知功能序列,命名为BmTmC27(GenBank登录号:DY231073.1)。生物信息学分析结果表明该基因全长833 bp,由558 bp的开放阅读框、102 bp的5'端非翻译区和173 bp的3'端非翻译区组成,编码蛋白由185个氨基酸组成且含有4个跨膜区,预测蛋白分子质量为20.94 kD,等电点为7.38。将该基因片段与BmNPV的polh基因连接后克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核融合表达载体pGEX-4T-1-polh-BmTmC27,经IPTG诱导、SDS-PAGE分析表明目的蛋白以包涵体形式在E.coli BL21(DE3)中表达。利用多角体蛋白可溶于碱性环境的性质,采用调节pH值的方法纯化融合表达的重组蛋白GST-Polh-BmT-mC27,然后经TEV酶消化获得BmTmC27蛋白。荧光定量PCR分析BmTmC27在家蚕5龄幼虫不同组织中的表达存在明显差异,其中在脂肪体、中肠和气管中的转录水平较高。利用GST沉降技术研究了BmTmC27的互作蛋白,与对照组相比,发现了4条特异性互作蛋白条带。研究结果有助于进一步探究BmTmC27的生物学功能,也为膜蛋白的表达和纯化提供了一种新方法。     

扁蓿豆SK2型脱水素基因MrDHN3的异源表达提高大肠杆菌对盐和高温胁迫的抗性

扁蓿豆为高原高寒地区优质豆科牧草,具有极强的抗旱、耐寒、抗盐碱的能力。脱水素(DHNs)是参与植物逆境应答的一类蛋白。根据前期RNA-seq的结果,从扁蓿豆幼苗中克隆到一个编码脱水素的基因MrDHN3。序列分析显示该基因含666 bp的开放阅读框,编码221个氨基酸,为一个SK2型酸性脱水蛋白。氨基酸序列比对结果表明,MrDHN3与豆科植物白三叶和蒺藜苜蓿相似性最高,达83%。实时荧光定量PCR结果显示,MrDHN3基因受脱水、低温、高盐和脱落酸处理诱导表达,表明MrDHN3参与了扁蓿豆的非生物胁迫响应。通过构建原核表达载体,在大肠杆菌中过表达MrDHN3蛋白,检测重组菌在盐和高温胁迫处理下的生长存活情况。结果发现,在0.5 mol/L NaCl和0.5 mol/L KCl高盐胁迫条件下,重组大肠杆菌的存活率明显高于对照菌株;在55 ℃高温胁迫条件下, 转化大肠杆菌的生长状态明显优于对照。表明MrDHN3对盐和高温引起的细胞损伤具有保护作用。为今后作物抗逆性遗传改良的研究提供了有用信息。     

鸡毒支原体黏附蛋白PvpA的原核表达与纯化

利用基因重组技术将PvpA基因的PCR扩增产物与原核表达栽体pET-41a(+)连接,转化入DH5a感受态细胞,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21(D3)受体菌,用IPTG诱导蛋白表达.用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备PvpA蛋白多克隆抗血清,并用Western blotting检验抗体特异性.结果表明,本研究成功获得PvpA纯化蛋白,在免疫印迹试验中,兔抗PvpA高免血清能与目的蛋白发生阳性反应,证实表达产物为特异性蛋白.     

H9N2亚型猪流感病毒血凝素基因的表达及LAT诊断方法的研究

根据H9N2亚型猪流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物,从本室分离保存的H9N2亚型猪流感病毒中扩增出血凝素基因,并将其克隆进pMD18-T载体,限制性酶切及序列测定后,进一步将其信号肽缺失并亚克隆到pGEX-KG中,使其在E.coli BL21（DE3）中与GST融合表达。SDS-PAGE显示表达的融合蛋白的相对分子质量约为90 000。Western印迹表明表达的蛋白质具有免疫学活性。表达产物位于包涵体中,包涵体经变性、复性处理,利用复性产物作为抗原,经碳二亚胺（EDAC）将表达产物和羧基化的乳胶共价偶联,建立了H9亚型猪流感病毒抗体的乳胶凝集试验的检测方法,结果表明,应用HA重组蛋白作为诊断抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于H9亚型猪流感抗体水平监测、流行病学调查和现地疫病普查。