马疱疹病毒1型gB糖蛋白线性B细胞表位的预测与鉴定

试验旨在应用生物信息学技术综合分析马疱疹病毒1型（equine herpesvirus 1,EHV-1） gB糖蛋白,预测B细胞表位,筛选出具有潜在诊断价值的线性B细胞表位。将EHV-1 gB糖蛋白的基因序列输入DNAStar软件中的Protean工作区中,经参数综合比较分析筛选潜在的B细胞表位,克隆、表达预测表位的基因片段,利用表达的融合蛋白作为抗原与马疱疹病毒阳性血清反应。经预测分析,gB糖蛋白的B细胞表位可能位于第6-10、23-32、53-65、72-98、111-120、152-166和173-180位氨基酸区域。本试验成功构建并原核表达含7个潜在B细胞表位的融合蛋白。Western blotting试验结果显示,其中5个融合蛋白能被马疱疹病毒阳性血清识别。本试验利用生物信息学技术结合分子生物学技术成功筛选到5个潜在的B细胞表位,为EHV-1表位诊断、表位疫苗抗原的设计奠定了技术基础。     

猪δ冠状病毒RBD蛋白多肽抗体的制备与鉴定

【目的】设计合成猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)受体结合结构域(receptor binding domain, RBD)的抗原表位,制备并鉴定多克隆抗体。【方法】为了特异性检测PDCoV RBD抗原,应用生物信息学技术预测其潜在抗原表位,将表位氨基酸序列与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株以及14株其他猪冠状病毒株进行相似性比对,将筛选的优势抗原表位与载体蛋白血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)偶联,合成多肽并免疫小鼠,制备PDCoV RBD特异性抗体。通过Western blotting试验对不同系统表达的PDCoV RBD以及PDCoV、TGEV和PEDV感染ST细胞表达的S蛋白进行鉴定,通过间接ELISA方法测定抗体效价。【结果】经序列比对,利用生物信息学技术预测合成的表位抗原与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株(0～14.28%)以及14株其他猪冠状病毒株(0～7.14%)序列相似性非常低,具有良好的保守性;Western blotting结果显示,制备的多肽抗体1∶500、1∶1 000、1∶2 ...     

猪源戊型肝炎病毒ORF2部分基因的原核表达及其鉴定

本试验旨在表达猪源戊型肝炎病毒(sHEV)ORF2部分基因片段,纯化表达产物并进行抗原性分析。以sHEV的cDNA为模板,PCR扩增ORF2基因片段,构建重组质粒pET32a-dORF2,转化表达菌BL21,IPTG诱导,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blotting进行检测。试验结果表明,获得60 ku的目的蛋白,该蛋白具有良好的抗原性,主要以可溶性形式存在。     

密码子优化型鸭甲肝病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达

为了提高基因A型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）VP1基因在昆虫细胞中的表达水平,本研究根据昆虫细胞密码子偏爱性对野生型DHAV VP1（wtVP1）基因进行改造,合成了optiVP1基因,并利用Bac-to-Bac表达系统构建了重组杆状病毒rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1,分别转染对数生长期的sf9昆虫细胞表达VP1蛋白。转染72 h后,sf9细胞出现典型的细胞病变（cytopathic effect,CPE）, Western-blot和间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果表明VP1蛋白在重组杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中获得了良好表达。用Image J软件对Western-blot扫描的图片进行灰度分析发现, optiVP1基因在昆虫细胞中的表达水平明显高于wtVP1。本研究为进一步研制诊断抗原和新型基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

猪戊型肝炎病毒ORF2基因的分段原核表达及抗原表位的初步鉴定

为了初步鉴定猪戊型肝炎病毒(sw HEV)ORF2蛋白的抗原表位,通过设计两对引物,PCR扩增ORF2-1和ORF2-2两段基因片段,使用p MD18-T载体克隆,双酶切后构建重组质粒p ET32a-0RF2-(1,2),转化大肠杆菌BL21后进行IPTG诱导和SDS-PAGE凝胶电泳,最后用4株ORF2单抗对其进行Western Blot来初步鉴定其抗原表位。结果表明,分别获得约为36 ku和35 ku的两个目的蛋白,均以不可溶形式存在,抗原表位初步定位于ORF2-1这段蛋白中的414~523 aa。     

表达猪圆环病毒2型Rep蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起断奶仔猪多系统衰弱综合征的主要病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。为了探究ORF1基因结构及其与功能的关系,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2的ORF1基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,获得重组转移载体pFBD-ORF1,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有ORF1基因的重组穿梭载体rBacmid-ORF1,经脂质体介导转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rAc-Rep,SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为36ku的特异性条带,表明rAc-Rep在sf9中成功表达了PCV2Rep蛋白。     

猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达

本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1^TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。     

PPV VP2基因与PCV2 ORF2不同抗原表位重组真核表达载体的构建及其免疫原性

为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPV VP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPV SC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、C(A:117～131aa,B:157～183aa,C:165～200aa)和PPV VP2基因。将A、B、C基因分别与PPV VP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPV VP2蛋白和PCV2ORF2抗原表位的重组质粒pCI-A-VP2、pCI-B-VP2、pCI-C-VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4+/CD8+细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI-B-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。     

猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区的原核表达

用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端的主要抗原表位区。通过对GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列进行分析,确定了其N端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了1对特异性引物,RT-PCR扩增该区段,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2N,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/LIPTG37℃诱导表达。RT-PCR扩增得到424 bp的片段,重组蛋白大小约为21.8 ku,与预期大小相符。West-ern blotting分析结果表明,该蛋白能与阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有一定的反应原性,为进一步用其建立诊断方法奠定基础。     

猪圆环病毒2型CAP蛋白在flashBAC杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

试验旨在通过真核表达系统表达猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2） CAP蛋白。以PCV2 TZ0601株为模板,将PCV2 CAP全基因及CAP去除信号肽的基因编码序列克隆至pOET3载体上,酶切与测序鉴定正确后,将重组质粒pOET3-CAP及pOET3-CAP-X转染sf9昆虫细胞。采用flashBAC杆状病毒表达系统表达PCV2 CAP及去除信号肽的CAP蛋白,通过间接免疫荧光法、SDS-PAGE 和Western blotting鉴定目的蛋白的表达。结果表明,真核表达质粒pOET3-CAP及pOET3-CAP-X构建成功,目的基因在sf9昆虫细胞中高效表达,得到的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,在25~35 ku处有蛋白条带,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别。试验结果为进一步制备PCV2亚单位疫苗及诊断抗原试剂盒的研发奠定了基础。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

牛环形泰勒虫enolase基因的原核表达及生物信息学分析

【目的】获得牛环形泰勒虫(Theileria annulata)新疆株enolase基因,并分析其生物学特性及反应原性。【方法】对牛环形泰勒虫enolase基因进行扩增和克隆,构建原核表达载体pGEX-4T-1-enolase,诱导表达enolase重组蛋白并进行蛋白纯化,通过Western blotting验证enolase重组蛋白反应原性。利用生物信息学方法对enolase基因编码蛋白的理化性质、亲疏水性、跨膜区、信号肽、磷酸化、亚细胞定位及蛋白互作网络进行预测分析。【结果】PCR扩增出大小为1 248 bp的牛环形泰勒虫enolase基因片段,enolase重组蛋白大小约70 ku;Western blotting结果表明,该重组蛋白与牛环形泰勒虫阳性血清发生反应。enolase基因编码416个氨基酸,理论等电点为5.91,有38个磷酸化位点;二级结构主要由α-螺旋(43.03%)和无规则卷曲(33.17%)组成;具有17个B细胞抗原表位,亚细胞定位主要位于细胞质中;enolase蛋白与磷酸甘油酸变位酶(PGAM)、二磷酸核苷激酶(NDK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、热休克蛋白70(HSP70)存在相互作用。【结论】本试验成功克隆出新疆牛环形泰勒虫enolase基因,蛋白互作网络预测其与糖酵解和能量代谢相关的蛋白相互作用。研究结果为牛环形泰勒虫能量代谢途径基因的相关研究奠定基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性抗原表位重组腺病毒的构建及鉴定

猪圆环病毒2型PCV2ORF2基因表达的Cap蛋白含有病毒的主要抗原表位,是PCV2基因工程苗研究的主要候选蛋白。根据GenBank公布的PCV2基因序列设计1对PCR引物,从感染有PCV2的PK-15细胞中扩增出包含2个特异性表位的Cap蛋白基因片段。把Cap蛋白基因目的基因克隆入腺病毒5型穿梭质粒中,构成重组穿梭质...     

肠炎沙门菌avrA蛋白的原核表达及其生物信息学分析

【目的】 表达具有生物学活性的肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis） avrA蛋白,并对其进行生物信息学分析,为研究肠炎沙门菌avrA蛋白对猪肠道细胞免疫功能的影响提供参考。【方法】 根据GenBank中肠炎沙门菌avrA蛋白全基因序列（基因ID：1254388）设计引物扩增avrA基因,回收的目的片段与表达载体pGEX-4T-1进行重组、克隆,用限制性内切酶和基因测序验证重组表达质粒的正确性。将验证后的重组表达质粒转化大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞,并在不同条件下对重组表达菌进行诱导表达。应用SDS-PAGE和Western blotting检测avrA蛋白的表达情况。将酶切测序后目的基因序列进行BLAST比对分析,并用ExPASy-Translate Tool软件预测avrA蛋白的氨基酸组成。应用生物信息学软件预测avrA蛋白的跨膜结构域、二级结构、三级结构及抗原性。【结果】 肠炎沙门菌avrA基因CDS序列全长为909 bp,编码302个氨基酸。限制性内切酶及基因测序分析结果表明,重组表达质粒pGEX-4T-1-avrA构建成功。SDS-PAGE和Western-blotting结果表明,重组菌所表达的avrA蛋白为可溶性蛋白。重组菌在15 ℃诱导16 h表达的蛋白量为10 mg/L,蛋白溶解度为40%。生物信息学分析表明,avrA蛋白为膜外蛋白,该蛋白的16―301位氨基酸具有来自超家族YopJ丝氨酸/苏氨酸乙酰转移酶的保守结构域;avrA蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、延伸链分别占43.71%、39.40%和16.89%;avrA蛋白三级结构预测结果与二级结构一致;avrA蛋白有9个与B细胞结合的抗原表位,分别在第5―40、51―68、80―92、94、101―109、146―157、160―168、199―231和236―298位氨基酸处。【结论】 试验成功克隆出肠炎沙门菌avrA基因,并成功构建重组表达质粒和表达菌,诱导表达的avrA蛋白为可溶性表达;avrA蛋白为膜外蛋白,有9个能与B细胞结合的抗原表位。本研究结果为进一步制备检测肠炎沙门菌感染的抗体提供参考。     

猪圆环病毒2型杆状病毒的构建及在Hi5细胞中高效表达

研究克隆PCV2 SY株ORF2基因序列,对N端细胞核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)区域11个氨基酸进行点突变,突变后的ORF2基因先后克隆至pUC57和转移载体pBacF,经PCR及酶切鉴定正确后,转染sf9细胞获得重组杆状病毒,重组杆状病毒在Hi5细胞进行感染及cap蛋白表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果表明,在Hi5细胞28 kDa处有一可被PCV2阳性血清识别的外源cap蛋白高效表达;Hi5细胞中的cap蛋白产量比sf9细胞中产量高,而且比较稳定,均达到350～550μg/mL;同时经蛋白测序得出,上述蛋白序列与NCBI数据库PCV2病毒cap序列配对率达93.59%以上。     

PPVVP2基因与PCV2ORF2不同抗原表位重组真核表达载体的构建及其免疫原性

为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPVVP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPVSC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、c（A：117～131aa,B：157～183aa,C：165～200aa）和PPVVP2基因。将A、B、C基因分别与PPVVP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPVVP2蛋白和PCV20RF2抗原表位的重组质粒pCI—A—VP2、pCI13-Vp2、pCI—C—VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4＋／CD8＋细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI—13-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。     

密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

【目的】试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。【方法】根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBac^TM Dual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。【结果】试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,...     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白(Cap)在293T细胞中的亚细胞定位

猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。     

环形泰勒虫表面抗原Tasp-Spag1基因串联表达及其蛋白生物信息学分析

研究环形泰勒虫表面抗原特性,以原核表达系统串联表达其表面抗原Tasp-Spag1,并对其蛋白进行生物信息学分析。通过PCR技术扩增Tasp-Spag1基因片段后构建重组质粒pET-28a-Tasp-Spag1,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE、Western blot检测;运用生物信息学软件对Tasp-Spag1基因片段进行分析,并预测其编码蛋白的主要特性与抗原表位。结果显示,扩增得到Tasp-Spag1基因长度为729bp,原核表达后通过SDS-PAGE与Western blot检测显示,得到大小与预期分子质量相当的目的蛋白;生物信息学分析发现,此串联重组蛋白Tasp-Spag1具有236个氨基酸,属于不稳定的非分泌型、非跨膜亲水蛋白,分别具有33个与21个可能的糖基化与磷酸化位点,有三段低复杂性的结构域,并且含有Sorb、NL的同源区域,可能有10个B细胞表位优势区段与7个T细胞表位优势区段,具有两段交叉反应性表位肽。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析

为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。