副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

本试验采用121 ℃高压处理副猪嗜血杆菌4型和5型耐热蛋白,混合作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度为10 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液选择含20 g/L脱脂奶粉的PBST,封闭30 min;血清的稀释度为1∶80;抗原抗体反应时间为45 min;酶标二抗稀释度为1∶12000,作用时间为30 min;底物显色时间为15 min。特异性、重复性和敏感性试验及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,对已知阴阳性血清的临床样本检测结果与国外ELISA试剂盒一致,可用于副猪嗜血杆菌的血清抗体检测和血清流行病学调查。     

猪副嗜血杆菌病诊断方法的研究进展

猪副嗜血杆菌是呼吸道常在的条件致病菌,可引起猪体温升高、呼吸困难、关节肿胀等症状,严重危害仔猪和青年猪的健康。目前,猪副嗜血杆菌的诊断方法较多,主要有菌体分离鉴定、间接血凝抑制、ELISA法、PCR法等。以上检测方法各有利弊,笔者简要分析下实验室常用的几种诊断方法的优缺点,为临床上猪副嗜血杆菌病的诊断提供参考。     

江西省部分猪场副猪嗜血杆菌病血清学调查

为调查江西省副猪嗜血杆菌病的流行情况,采集未进行疫苗免疫接种的11个猪场150份血清,应用间接血凝试验检测其抗体滴度,结果表明本地区副猪嗜血杆菌抗体总阳性率为44%,其中母猪阳性率偏高,说明该省猪场存在一定程度的副猪嗜血杆菌的感染.     

川藏公路拉萨-林芝沿线藏猪副猪嗜血杆菌病的病原分离鉴定与耐药性调查

根据拉萨-林芝公路沿线藏猪副猪嗜血杆菌血清抗体流行状况,在针对拉萨-林芝公路沿线12乡镇藏猪的间接血凝抗体ELISA检测结果基础上,成功分离到藏猪副猪嗜血杆菌的菌株,并筛选出敏感药物。分离株对氟苯尼考、环丙沙星为高度敏感,对恩诺沙星、磺胺嘧啶、青霉素G、庆大霉素中度敏感,对氨苄西林不敏感,有很强的耐药性。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆、表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌的外膜蛋白ompP2基因,序列测定结果表明扩增片段全长1 188bp。将扩增片段插入表达载体pET-32a,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果证实重组融合蛋白约为60 000,West-ern-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白ompP2作为抗原,建立副猪嗜血杆菌的抗体间接ELISA检测方法。通过试验确定最佳反应条件为抗原包被质量浓度4.75mg/L,4℃包被过夜,待检血清的稀释浓度为1∶40,阳性判断标准为D630大于0.383。特异性和重复性试验表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于副猪嗜血杆菌的检测。     

以原核表达的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学方法,本研究原核表达ASFV pK205R重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。结果显示,原核表达的ASFV pK205R蛋白约为44 ku,western blot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、副猪嗜血杆菌及猪大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法检测灵敏度为1∶2 560;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;利用该方法对临床样品检测的结果与国外商品化试剂盒检测结果符合率为100%。本研究建立的ASFV抗体间接ELISA方法为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供技术储备。     

青海省副猪嗜血杆菌病的血清学调查

采用间接血凝(IHA)试验,对来自青海省3个规模化猪场的209份血清,进行了副猪嗜血杆菌病的血清抗体检查.结果表明,检出51份阳性血清,阳性率为24.40%,表明青海省部分猪场中存在副猪嗜血杆菌的感染.     

广东部分猪场副猪嗜血杆菌病的流行病学调查

为了解副猪嗜血杆菌病(Haemophilus parasuis,HPS)在广东省部分地区的流行情况,通过针对副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2(OMPP2)的间接ELISA法对广东省部分猪场的376份猪血清样本进行了抽样检测。结果显示,副猪嗜血杆菌的阳性率为23.8%,其中母猪阳性率高达31%;保育仔猪为29%,育肥猪为33.6%,育肥猪阳性率显著高于母猪和保育仔猪;冬季(11～1月)副猪嗜血杆菌抗体阳性检出率最高为31.4%、秋季(8～10月份)的阳性检出率最高为18.7%,冬季比秋季高出12.7%,差异极显著(P<0.01)。     

平顶山市中小规模养猪场户副猪嗜血杆菌病及其混合感染的血清学调查

为了解平顶山市养猪场户副猪嗜血杆菌病流行现状及其混合感染情况。采用ELISA方法首先对8个乡镇22个养殖场户562份血清进行副猪嗜血杆菌病检测,其中384份为副猪嗜血杆菌病阳性,然后对此384份副猪嗜血杆菌病阳性血清进行H1N1亚型猪流感病毒病、猪支原体肺炎、猪圆环病毒病2型、猪链球菌病2型、猪传染性胸膜肺炎抗体检测。结果表明,猪场副猪嗜血杆菌病群体流行率为72.73%(16/22),副猪嗜血杆菌病个体流行率为68.32%(384/562),384份副猪嗜血杆菌阳性血清中,H1N1亚型猪流感、猪支原体肺炎、猪圆环病毒病2型、猪链球菌病2型和猪传染性胸膜肺炎阳性率分别为35.42%(136/384)、47.39%(182/384)、54.17%(208/384)、38.54%(148/384)和48.96%(188/384)。平顶山市养猪场户副猪嗜血杆菌病及其混合感染情况比较严重,应引起当地兽医部门的高度重视。     

天津部分猪场副猪嗜血杆菌病与猪传染性胸膜肺炎的流行病学调查

为了解天津部分猪场副猪嗜血杆菌病(HPs)和猪传染性胸膜肺炎(PCP)的流行情况,利用间接血凝试验对采自9个规模猪场的178份猪血清样品进行副猪嗜血杆菌抗体检测,对采自8个规模猪场的166份猪血清样品进行猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体检测。结果表明:副猪嗜血杆菌阳性率为18.54%(33/178),其中断奶仔猪和保育阶段猪阳性率为23.58%(25/106);猪传染性胸膜肺炎的阳性率为21.08%(35/166),其中断奶仔猪阳性率为20.93%(9/43),育肥猪阳性率为27.66%(13/47),种猪阳性率为21.62%(8/37)。说明天津地区部分猪场的副猪嗜血杆菌病和猪传染性胸膜肺炎呈地方性流行。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

对一例临床症状、病理剖检变化疑似副猪嗜血杆菌病的仔猪病料进行实验室诊断,进行了细菌培养特性和生化特性等鉴定,初步怀疑为副猪嗜血杆菌,根据副猪嗜血杆菌的16 S rRNA基因设计特异性引物进行PCR扩增鉴定,结果表明,分离菌为副猪嗜血杆菌.药敏试验显示,该分离菌对阿米卡星、头孢氨苄、新霉素高度敏感.     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定

副猪嗜血杆菌(Hps)为猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的重要病原之一。在对广西65个猪场281份病猪组织样品进行PRDC病原学调查的基础上,对PCR检测的Hps阳性样品进行了细菌分离,并进行了生化特性、药敏试验、16 S RNA基因片段序列分析和基因组DNA的PCR指纹图谱分析。结果显示,11份(3.91%)检测样品为Hps阳性,且均为混合感染;从南宁市四塘、桂林市永福、玉林市容县和钦州市浦北分离出5株Hps,分离菌株的生化鉴定结果均符合Hps生化特性,且对头孢噻呋和头孢菌素高度敏感;其中3株为血清5型,1株为血清12型,另1株未能定型;分离菌株16 S RNA基因片段之间及与GenBank其他一些代表菌株的核苷酸同源性在99%以上。     

间接血凝方法检测副猪嗜血杆菌抗体

将副猪嗜血杆菌(Hps)4、5、13型分离菌株超声产物致敏经戊二醛和鞣酸处理的绵羊红细胞,建立了检测Hps抗体的间接血凝试验方法。对15种血清型Hps阳性血清进行检测,结果均为阳性,抗体效价达1∶2⁵~1∶2¹⁰,敏感性明显高于琼脂扩散试验。对其它16种病毒和细菌的阳性血清进行检测,结果除胸膜肺炎放线杆菌有凝集外,其余均为阴性。对620份临床血清进行检测,阳性率为67.58%。结果表明,该方法敏感性较高、特异性强,可用于Hps抗体水平的检测和流行病学调查。     

副猪嗜血杆菌aroA基因的克隆与序列分析及2种三重PCR检测方法的建立

本试验对分离的5株副猪嗜血杆菌进行了"卫星" 生长试验、生化鉴定和PCR检测。通过对aroA基因序列进行分析,发现这5株菌同标准菌株相比,其核苷酸序列相似性为96.3%~99.8%,氨基酸序列相似性为98.2%~99.5%。此外,还建立了分别针对副猪嗜血杆菌(Hps)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)及猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的三重PCR检测方法;敏感性试验表明,三重PCR最低能检出Hps、PPV、PRV、PCV2的DNA分别为12、16、7.6和6.3 pg。     

副猪嗜血杆菌广东流行株的分离鉴定与基因分析

本研究从广东省各个地区送检病料中成功分离鉴定了4株副猪嗜血杆菌,并且针对副猪嗜血杆菌16S rRNA基因特异性进行PCR检测和基因测序同源性分析,通过GenBank联机比对分析,所分离的菌株与国内外菌株16S rRNA序列同源性在98.2%以上,分离菌株之间同源性在99.6%~100%之间,证明了所暴发的菌株是副猪嗜血杆菌。     

副猪嗜血杆菌病原检测及aroA基因PCR-RFLP分型

本试验应用PCR方法及PCR-RFLP技术对aroA基因在副猪嗜血杆菌病原检测及基因分型中的作用进行探讨。以针对aroA基因的PCR引物成功检测出18株来自广西各地区猪场的副猪嗜血杆菌,敏感性检测结果表明,该PCR方法可检测的最低菌数为10²个。对该18株副猪嗜血杆菌进行aroA基因的序列测定,并进行aroA基因的酶切位点分析,筛选出Hind Ⅲ和FokⅠ两种限制性内切酶,利用PCR-RFLP技术对1株血清5型参考菌株与本研究中18株广西菌株aroA基因的完整编码序列进行Hind Ⅲ和FokⅠ限制酶谱分析,结果显示可分为与毒力相关的3种谱型。本研究结果表明,应用PCR方法及PCR-RFLP技术对副猪嗜血杆菌进行检测分析有助于更好地研究副猪嗜血杆菌的生物学特性及aroA基因的功能。     

屠宰生猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药物敏感性分析

为调查屠宰生猪副猪嗜血杆菌（Hps）的隐性感染情况,本研究从陕西省某规模化生猪屠宰场采集80份病变肺脏,应用PCR方法进行Hps核酸检测,无菌取阳性肺脏,通过平板划线分离获得疑似Hps,进一步对分离菌进行形态观察、培养特性分析、卫星现象观察、生化试验和分离菌核酸片段序列分析,纯化获得Hps分离菌;用药敏纸片法分析Hps分离菌株对常用药物的敏感性。结果显示,从80份病变肺脏中检出39份Hps阳性,阳性率48.75%（39/80）;从39份Hps阳性肺脏中分离获得3株疑似Hps,分离菌在显微镜下呈革兰氏阴性、短杆状;在添加有胎牛血清和NAD的TSA平板上生长良好;在金黄色葡萄球菌周围呈现出典型的"卫星现象"生长;能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖和阿拉伯糖,不发酵甘露醇;PCR扩增序列与Hps同源性在98%以上。药物敏感性试验结果显示,3株分离菌对环丙沙星、恩诺沙星和氟苯尼考等抗菌药物高度敏感,对青霉素、林可霉素和甲氧苄啶等抗菌药物耐药。本研究获得的Hps分离株为疫苗研制提供了基础材料,为生猪养殖场选择敏感药物防控Hps感染提供了参考依据。     

副猪嗜血杆菌的分型技术研究进展

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)是猪的一种条件致病性病原菌。近年来世界各地副猪嗜血杆菌病的发生呈显著上升趋势,猪只感染后表现为多发性浆膜炎和关节炎,给养猪业造成巨大的经济损失。随着分子生物学技术的发展,用于副猪嗜血杆菌分型鉴定的方法亦越来越多。本文就目前国内外常用的技术方法作一综述,以期为该病的流行病学调查、兽医临床诊断与治疗提供参考。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2的提取及鉴定

为简化副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）外膜蛋白中的单一蛋白外膜蛋白P2（OmpP2）的分离步骤,降低膜蛋白分离的设备要求,本试验用Hps标准3型（SW114）、5型（Nagasaki）菌株作为试验材料,选用溶菌酶、核酸酶对Hps进行酶解以获得其完整外膜,然后利用含有2% tritonX-100缓冲液对外膜进行进一步解离,最后利用适量浓度的胰酶对强疏水蛋白进行酶解,实现了Hps高纯度OmpP2的体外快速提取。SDS-PAGE结果显示,上述2株菌OmpP2大小分别约为43和38 ku;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF）鉴定结果显示,从上述蛋白酶解下来的肽段经比对与Hps的OmpP2完全吻合。斑点杂交（Dot-blot）显示采自Hps患病猪血清在点有5型菌株（Nagasaki）OmpP2和点有3型菌株（SW114）OmpP2 NC膜上均发生杂交显色反应,该结果暗示OmpP2是一个具有免疫活性的抗原。本研究为OmpP2功能及免疫保护性研究奠定了基础,也为副猪嗜血杆菌病免疫学诊断提供新的参考。