马铃薯3种病毒的多重PCR检测方法构建

[目的]构建马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）3种马铃薯主要易受感染的病毒多重PRC（multiplex PCR）检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX（Potato virus X）、PVM（Potato virus M）、PVS（Potato virus S）、PVV（Potato virus V）,CMV（Cucumber mosaic virus）等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限：PVA为100 copies/2μl,PVY为100 copies/2μl,TMV为1 000 copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]该研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。     

用小RNA深度测序鉴定广西冬种马铃薯病毒

【目的】对广西冬种马铃薯病毒进行鉴定,为无病毒种薯选择和大田防治提供依据。【方法】2012年在马铃薯主要产区采集具有明显病毒病症状的样品,在血清学ELISA检测的基础上,进一步用小RNA深度测序对按症状分类的样品进行混合样本的病毒种类鉴定,再用RT-PCR方法对分组混合样本进行验证。【结果】在109个样本中检测到马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）、马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、马铃薯H病毒（Potato virus H,PVH）、马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）、马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）和马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）,同时发现PVS有丰富的株系分化。【结论】近年广西冬种马铃薯病毒种类增多,病症多样,亟需加强种薯管理,培育无毒健康种薯。     

马铃薯病毒疫情调查及马铃薯S病毒的检测鉴定

[目的]了解河北省张家口市马铃薯病毒病害发生情况并对马铃薯S病毒（PVS）进行鉴定。[方法]对采自河北省张家口市的46份马铃薯样品进行生物学测定和血清学及分子生物学检测。[结果]46份样品中有35份为马铃薯Y病毒（PVY）侵染,其中有6份是PVY与PVS混合侵染,其余29份为PVY单独侵染。用特异性引物扩增PVS外壳蛋白基因的部分序列,获得685bp的目的产物,该序列与已报道的PVS核苷酸序列同源性在80％以上,编码227个氨基酸,与已报道的PVS外壳蛋白的氨基酸同源性均在90％以上。证明该样品中确实携带PVS。[结论]该研究为今后该地区马铃薯病毒病害的控制及防治提供了依据。     

三重RT-PCR快速检测多种马铃薯病毒的研究

依据马铃薯X病毒、S病毒、A病毒及卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录反应中dNTPs浓度、退火温度、PCR反应中Mg2＋浓度、循环条件4方面优化三重RT-PCR反应条件,可以同步扩增出上述4种病毒,分别得到620bp（PVX）、435 bp（PVS）、300 bp（PVA）、222 bp（PLRV）大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中dNTPs浓度和PCR反应中Mg2＋对整个反应的影响最大;其次是退火温度;循环条件对RT-PCR影响较小。优化的三重RT-PCR反应体系为马铃薯病毒的检测提供了一种快速、灵敏、简便的方法,对马铃薯病毒的早期检测和防治提供了有效手段。     

PSTVd，PLRV和PVS在马铃薯试管苗不同部位继代积累规律研究

 为研究病毒和类病毒在马铃薯试管苗不同部位的积累规律,利用实时荧光定量PCR和DAS-ELISA两种方法检测马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid, PSTVd)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus, PLRV)和马铃薯S病毒（Potato virus S, PVS）在马铃薯试管苗基部和顶端继代培养5代（继5代）后的含量。结果表明：PSTVd,PLRV和PVS在马铃薯试管苗常规组织培养过程中是逐代传递的,其在马铃薯试管苗顶端和基部的积累规律存在显著的品种差异,分别供试的7个品系中,存在PSTVd顶端积累和基部积累效应的各3个品系,存在PLRV顶端积累和基部积累效应的分别为4个和2个品系,存在PVS顶端积累和基部积累效应的分别为3个和2个品系,其中PSTVd的顶端积累效应最强为基部的4倍;同一马铃薯品系的顶端和基部对不同病毒和类病毒的积累趋势相对一致。实时荧光定量PCR是一种灵敏度很高的定量检测马铃薯病毒和类病毒的方法。     

乌鲁木齐马铃薯病毒病种类及防治措施

我国马铃薯生产田中主要病毒为PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA和PVM。本试验选取乌鲁木齐地区马铃薯脱毒试管苗、原原种、各级良种共86个样品,应用酶联免疫吸附试验（DAS-ELISA）方法对6种病毒进行检测,分析乌鲁木齐地区脱毒马铃薯各级种薯病毒携带情况,以便更好地了解本地脱毒马铃薯种薯质量。为有针对性地防治马铃薯病毒病提供理论依据。     

应用RT-PCR技术检测宁夏地区马铃薯脱毒试管苗病毒报告

为进一步推动宁夏马铃薯种薯产业健康、稳定和可持续发展,了解宁夏地区马铃薯脱毒试管苗带有病毒残留的基本情况,本研究对宁夏银北和银南地区11个主要的马铃薯脱毒试管苗品种利用RT-PCR技术分别了检测PVX、PVY、PVS和PLRV4种常见病毒。检测结果显示:宁夏银北和银南地区马铃薯脱毒试管苗主要品种均不带有PVX、PVY、PLRV病毒,但是银北和银南地区的庄薯3号均带有带有PVS病毒。     

我国部分马铃薯产区主要病毒病发生情况调查

为探明我国马铃薯产区主要病毒病的发生情况,采用RT-PCR技术对我国9个省、市16个马铃薯种植区的田间马铃薯病毒病发生情况进行了调查.结果表明:马铃薯Y病毒(PVY)检出率最高,达到94％,其次是马铃薯S病毒(PVS)和马铃薯A病毒(PVA),检出率分别为50％、44％.其中PVA在贵州省、PVS在河南省和吉林省的发生尚属首次报道.病毒复合侵染情况普遍,复合侵染率达81.3％.另外,对我国部分地区脱毒试管苗和脱毒种薯的带毒情况进行检测,结果表明:在脱毒试管苗中4种病毒均有检出,其中PVS检出率最高(22.2％),其次为马铃薯卷叶病毒(PLRV)、PVY和PVA,但在脱毒种薯中未检出病毒.我国马铃薯田间病毒病发生普遍,且多为复合感染.     

马铃薯三种病毒的多重PCR检测方法构建(英文)

[目的]构建马铃薯A病毒(Potato virusA,PVA)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus,TMV)、马铃薯Y病毒(Potato virusY,PVY)3种马铃薯主要易受感染的病毒的多重PRC(multiplex PCR)检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX(Potato virus X)、PVM(Potato virus M)、PVS(Potato virus S)、PVV(Potato virus V),CMV(Cucumber mosaic virus)等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限:PVA为100落copies/2μl,PVY为100copies/2μl,TMV为1000copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。     

云南省马铃薯病毒及蓟马优势种发生趋势

【目的】明确云南省马铃薯病毒的优势种及马铃薯新病毒的发生变化,为马铃薯种苗、种薯的生产提供早期预警监测,并为防止新的病毒病害暴发流行提供依据。【方法】采用随机五点取样法,从云南马铃薯春作区和冬作区的不同田块采集各地主栽马铃薯品种的叶片,共采集到510份植株叶片,采用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法中的双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）和间接ELISA（I-ELISA）两种方法进行病毒检测。进行蓟马采集时,同样采用随机五点取样法,从云南马铃薯春作区和冬作区采集各地主栽马铃薯品种的花和叶片,将样品放入采集罐后带回实验室,对罐中的蓟马进行整理,共采集到8 953头蓟马。将蓟马制作为临时玻片标本,参考中国蓟马属蓟马检索表及Oz Thrips（http://www.ozthrips.org/）,通过形态学特征对蓟马进行种类鉴定。【结果】从510份马铃薯样品中,共检测出6种常见病毒和2种新兴病毒。马铃薯病毒的优势种为马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）,检出率高达63.53%,其次是马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）和马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）;检测出2种新兴病毒番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）和番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus,TZSV）,检出率分别为5.10%和15.10%。本次调查共鉴定了3科,5属,13种蓟马。蓟马科(Thripidae)共鉴定出3个属11个种,分别为蓟马属(Thrips)的八节黄蓟马（T. flavidulus）、黄蓟马（T. flavus）、棕榈蓟马（T. palmi）、烟蓟马（T. tabaci）、黄胸蓟马（T. hawaiiensis）、色蓟马（T. coloratus）、暗足蓟马（T. obscuripes）和葱韭蓟马（T. alliorum）;花蓟马属(Frankliniella)的西花蓟马(F. occidentalis)、花蓟马（F. intonsa);带蓟马属(Taeniothrips)的大带蓟马(Ta. major);管蓟马科(Phlaeothripidae)简管蓟马属（Haplothrips）的简管蓟马（Haplothrips sp.）和纹蓟马科(Aeolothripidae)纹蓟马属（Aeolothrips）的纹蓟马（Aeolothrips sp.）。检测出的8种病毒中TSWV和TZSV是蓟马传播的病毒,其中,西花蓟马是潜在传毒蓟马群体中的优势种,占潜在传毒蓟马群体总数的69.47%。【结论】目前,PVS是云南马铃薯主要病毒优势种,2种侵染马铃薯的新兴病毒的发生率也在增加。西花蓟马是潜在传毒蓟马群体中的优势种。     

我国马铃薯主产区病毒病发生情况调查

为了解我国马铃薯病毒病发生情况,在马铃薯主产区黑龙江、内蒙古、甘肃、云南等马铃薯田采集了具有典型病毒病症状的样品、疑似样品和随机无症样品,试管苗和原原种为随机样品,共649份。应用DASELISA方法筛查6种马铃薯主要病毒:PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA。结果表明:129份样品为阳性,PVY的检出率最高,为9.86%,PVS次之,为6.47%;试管苗PVS检出最多,为32份,原原种PVX检出最多,为10份,大田样品PVY病毒发生比例最高,为54份;有38份样品是由多种病毒复合侵染造成的,大田PVY+PVS复合侵染率最高,为2.93%,PVS+PVY+PLRV次之,为0.98%,试管苗PVS+PVM复合侵染率最高,为4.85%。通过历年的检测结果比较,试管苗中PVS病毒检出率最高,原原种中PVX和PLRV病毒成为危害最为严重的病害,大田样品中PVY检出率一直居高不下。     

双重RT-PCR法快速检测多种马铃薯病毒的研究

为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒病早期监测有一定的作用。     

同时快速检测马铃薯X病毒、Y病毒和S病毒试纸条的研制

为实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯X病毒(PVX)、Y病毒(PVY)和S病毒(PVS),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,利用抗体与胶体金相结合的特性制备金原子与PVX、PVY和PVS抗体结合物(简称金标抗体),通过三维划膜喷金仪将金标抗体喷射于玻璃纤维上作为金标垫,将PVX抗体、PVY抗体和PVS抗体分...     

不同脱毒技术对马铃薯病毒脱毒效果的影响

以三个感染了不同病毒的马铃薯品种作为试验材料,研究了3种不同的马铃薯脱毒技术,对脱毒效率及脱毒苗的成活率进行对比研究,筛选出不同病毒种类最适宜的脱毒技术方法。用茎尖剥离,热处理结合茎尖剥离技术和病毒唑结合茎尖剥离技术,设计不同的热处理周期和病毒唑浓度对材料进行脱毒处理,在计算植株的成活率及成苗率的基础上对其进ELISA检测法检测脱毒率。试验结果表明以上三种方法中热处理加茎尖剥离和病毒唑加茎尖剥离的复合脱毒的方法在提高试管苗的脱毒率上有明显的优势,单一的茎尖剥离处理的茎尖成活率及脱毒率普遍较低。通过变温热处理加茎尖剥离处理中(5周)热处理时PVY, PLRV, PVS均可达到较高的脱毒。脱毒率最高为V病毒100%。病毒唑浓度为45mg/L时,通过病毒唑及茎尖剥离方法得到的PVY和PLRV的最高脱毒率为100%。PVS的最高脱毒率为92%(结论)。比起单一的茎尖剥离技术复合脱毒技术较有优势,在5周的热处理加茎尖剥离技术(只取一个叶原基的茎尖)处理适合PVS病毒的脱毒。变温热处理培养后茎尖剥离处理适于PVY病毒脱毒。试验中三种方法均适合脱去PLRV病毒。经过设计不同的热培养温度和化学处理浓度...     

应用改进的DAS-ELISA法快速检测马铃薯病毒

试验分别用改进DAS-ELISA法和常规DAS-ELISA法对马铃薯4种主要病毒PVX、PVY、PVS、PLRV进行检测,其检测结果完全一致,且灵敏度也基本相同。改进法比常规法操作简便、节省时间,表明改进DAS-ELISA法是一种直观、实用、快速、准确可靠的检测方法,适合种薯生产中大量样品的多种主要马铃薯病毒的快速检测。     

马铃薯不同级别脱毒种薯病毒再侵染情况及产量变化

通过对大西洋原原种、一级原种、二级原种、一级种薯和二级种薯的生产试验及其PVX、PVY、PVS、PLRV病毒的DAS-ELISA检测,结果表明,从原原种到一级种薯的生产过程中,产量随着脱毒种薯代数的增加而升高,其中以二级原种生产一级种薯的增产幅度最显著;除原原种不带以上4种病毒外,一级原种、二级原种分别带3%、13.3%的PVS病毒,一级种薯带PLRV和PVS病毒,带毒率分别是5.8%、21%,二级种薯带PVY、PVS、PLRV病毒,带毒率分别是8.9%、30%、13%.