珍贵绢丝昆虫天蚕FXPRLamide家族神经肽的免疫组织化学鉴定

 利用Zooblotting、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫组织化学等方法，对天蚕的DH、PBAN等FXPRLamide家族神经肽进行鉴定。结果表明，标记的蓖麻蚕的DH-PBAN cDNA片断能够与天蚕、樟蚕、柳蚕和棉铃虫的基因组DNA结合。这证明了天蚕可能存在FXPRLamide家族神经肽中的DH－PBAN基因；天蚕的咽下神经节中FXPRLamide神经肽含量最高，咽下神经节有三簇细胞合成FXPRLamide神经肽，在胸神经节和腹神经节也有明显的阳性细胞；天蚕5龄幼虫的血淋巴中FXPRLamide神经肽含量比较稳定，化蛹前含量升高，蛹期含量降低。上述结果证明天蚕含有DH、PBAN等FXPRLamide家族神经肽，其对天蚕的滞育和性信息素合成等的调控还需要进一步研究。     

小麦PIN基因家族的鉴定及表达分析

【目的】PIN（puroindoline）是植物所特有的一类蛋白家族,对控制小麦籽粒硬度有重要功能。分析小麦PIN家族成员在全基因组的分布、结构及进化,研究其在不同组织的表达特异性以及在不同硬度种子的表达模式,为阐明小麦PIN基因家族的生物学功能奠定基础。【方法】根据已报道的小麦PIN基因和大麦HIN基因,利用BLASTP和HMM方法,在最新发布的小麦中国春参考序列中鉴定小麦PIN基因家族成员。利用UniProt、URGI、PFAM、CDD、expVIP等数据库,采用Clustal X、MEGA 7.0、ExPASy、MEME、GSDS、TB tools、GraphPad Prism5等软件进行生物信息学分析。采用qRT-PCR方法检测TaPIN基因家族在不同籽粒硬度小麦样品中的表达情况。【结果】共鉴定出19个小麦PIN基因,集中成簇分布于第1、5和7染色体同源群,编码148—327个氨基酸,编码蛋白相对分子量为16.39—37.19 kD,等电点为6.35—9.34。通过结构域和系统发育分析,可将19个TaPIN基因分为A和B两大类。大部分TaPINs基因仅有1个外显子,没有内含子,顺式作用元件分析发现其上游序列包含大量抗逆和种子发育相关的调控元件。转录组分析表明该基因家族在小麦籽粒中相对表达量很高,而在根茎叶等其他组织几乎不表达。实时荧光定量PCR表明,各基因间相对表达量差异显著,TaPIN9和TaPIN10表达量较高。随着小麦籽粒硬度降低,TaPIN9和TaPIN10表达上调,且表达比例增加,而TaPIN16和TaPIN6则呈现相反的趋势。【结论】小麦籽粒硬度的调节以Pina和Pinb为主,该基因家族其他成员也具有相同结构域,推测也具有相似功能,但受表达量低的限制,对籽粒硬度影响较小。从该基因的进化关系看,粗山羊草与小麦亲缘关系最近,其次是燕麦、黑麦和大麦。     

飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′的抗体制备及组织定位

【目的】LmKnickkopf3-5′(LmKnk3-5′)是飞蝗（Locusta migratoria）蜕皮发育中重要的表皮蛋白。本文旨在制备LmKnk3-5′特异抗体并对其进行组织定位,为LmKnk3-5′生物学功能研究提供蛋白水平的证据,同时为进一步深入探究LmKnk3-5′与其他表皮蛋白在飞蝗表皮形成过程中的协同作用打下基础。【方法】首先比对飞蝗Knickkopf(Knk)家族4个基因LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和LmKnk3-5′的氨基酸序列,选取LmKnk3-5′的3段特异抗原序列R1、R2和R3,设计包含BamH I、Hind III酶切位点的引物,以LmKnk3-5′全长cDNA为模板,PCR获得LmKnk3-5′的特异抗原片段;然后将特异抗原片段与pET-32a经双酶切、T4连接酶连接、测序验证、成功构建重组质粒后,转入BL21（DE3）表达菌株中,加入IPTG（终浓度0.5 mmol·L^-1）低温（16℃）诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况;接着扩大培养可在菌体裂解液的上清中表达重组融合蛋白的大肠杆菌,提取蛋白并用Ni-NTA对其进行纯化,之后再用纯化后的重组特异抗原免疫小鼠4次,获得anti-LmKnk3-5′多克隆抗体,ELISA法对其进行效价检测,并用Western blot法检测其特异性。取飞蝗5龄若虫第8天表皮,制备石蜡切片,通过免疫组化法对LmKnk3-5′蛋白进行组织定位。【结果】通过氨基酸序列比对,选取LmKnk3-5′的特异抗原区域R1、R2和R3,分别包含208、147和131个氨基酸残基,蛋白理论分子量分别为24.0、17.0和14.8 kD。酶切连接后,成功获得 pET-32a-R1、pET-32a-R2 和pET-32a-R3重组质粒。诱导表达检测,发现只有含pET-32a-R2的表达菌在菌体裂解液的上清液中大量表达重组蛋白。将其扩大培养纯化后获得 R2重组融合蛋白,免疫小鼠取抗血清进行效价检测,抗体效价高达1﹕512 000,可满足抗体使用需求。Western blot结果表明,注射dsLmKnk3-5′后飞蝗体壁LmKnk3-5′的蛋白表达显著减少,表明anti-LmKnk3-5′抗体特异性良好。免疫组化试验结果表明,表皮蛋白LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁皮细胞及新表皮中均有分布,特别是新合成的外表皮顶端。【结论】成功获得飞蝗LmKnk3-5′多克隆抗体,证明其特异性良好。LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁新合成的外表皮顶端分布较多。研究结果为飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′功能研究提供了蛋白水平的证据。     

苦荞WOX家族全基因组鉴定及响应愈伤诱导率表达分析

【目的】全基因组鉴定苦荞WOX（WUSCHEL-related homeobox）基因,揭示其基因家族成员序列特征、基因表达模式及与出愈率的相关性,为突破苦荞再生及遗传转化难题提供理论基础。【方法】基于同源性搜索策略,以拟南芥WOX基因蛋白为参考序列,进行苦荞全基因组比对,获得苦荞WOX基因家族成员蛋白及核酸序列。基于蛋白同源性及保守结构域分析,鉴定出苦荞WOX基因家族所有成员。同时使用TBtools软件展示FtWOXs家族成员基因结构、保守结构域及启动子顺式作用元件特征。比较分析WOX基因家族成员在苦荞与拟南芥之间的基因组共线性。基于邻近法,利用MEGA X软件构建苦荞、拟南芥和水稻WOX基因家族成员蛋白序列系统进化树。以MS+2,4-D 3.0 mg·L^-1+6-BA 1.0 mg·L^-1为愈伤诱导培养基,下胚轴为外植体,选取70份苦荞品种诱导愈伤组织,评价不同基因型的出愈率。qRT-PCR比较分析高、低出愈率苦荞品种间FtWOXs基因表达水平。基于Pearson相关系数分析出愈率与FtWOXs基因家族成员表达相关性。【结果】共鉴定出30个苦荞WOX基因成员,在苦荞8条染色体上呈现不均匀分布。系统进化树表明30个苦荞WOX基因可划分为3大类,不同类群中WOX基因包含不同的保守结构域,主要的保守结构域为HD（Homeodomain）、START和MEKHLA结构域。保守基序分析表明,FtWOXs基因家族成员所含保守基序数目的范围为2—10个。基因结构分析表明,FtWOXs基因家族成员所含外显子数目的范围为2—18个。顺式作用元件分析表明FtWOXs基因启动子富含26个不同种类的顺式作用元件。系统进化分析表明,30个苦荞、15个拟南芥和12个水稻WOX基因家族成员可分为3类,其中第3类为苦荞独有。基因组共线性分析表明,6个WOX基因在苦荞和拟南芥之间存在基因组共线性。表达模式及相关性表明,FtWOX1/FtWOX12/FtWOX22/FtWOX23/FtWOX24与苦荞出愈率存在正相关性。【结论】苦荞FtWOXs成员存在丰富的序列变异特征,不同苦荞基因型中WOX基因表达水平及出愈率存在明显差异和一定的相关性,揭示不同苦荞WOX基因具有潜在的功能多样性。     

葡萄SAP家族的鉴定与表达分析

【目的】通过生物信息学分析明确SAP（Stress Associated Protein）家族在葡萄基因组中的数量、结构,利用qRT-PCR技术分析SAP家族的生物节律和在激素、非生物胁迫处理下的表达模式,为进一步探究SAP家族在葡萄中的作用奠定基础。【方法】在前期从山葡萄‘双优’（Vitis amurensis cv. Shuangyou）和欧洲葡萄‘红地球’（Vitis vinifera cv. Red Globe）0℃寒胁迫下转录组数据库中筛选出表达量明显上调的基因SAP15基础上,利用NCBI和葡萄基因组数据库中的BLAST功能,根据SAP家族的保守结构域,鉴定葡萄基因组中的SAP。利用生物信息学软件DNAMAN5.0、MEME、GSDS2.0、ExPASy和MEGA6等对VvSAPs序列、基因结构、蛋白质结构、理化性质、染色体定位和进化树等进行分析。采用qRT-PCR方法检测VvSAP家族的生物节律和在激素、逆境处理下的表达特征。【结果】从葡萄（Vitis vinifera）全基因组中鉴定得到15个SAP家族成员,均含有AN1保守结构域,大多含有A20保守结构域。按照其保守结构域和在染色体上的位置,依次命名为VvSAP1—VvSAP15,可分为Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ三类。理化性质分析表明,VvSAP家族编码氨基酸数目介于109—293,理论等电点分布在7.99—9.68。染色体定位分析发现,该基因家族的15个基因分布于葡萄的9条染色体上,其中第8条染色体上分布最多,有3个VvSAP。亚细胞定位分析表明,VvSAP家族主要在细胞核、叶绿体和细胞骨架中进行表达。VvSAP家族的二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。基因结构分析表明,VvSAP1—VvSAP12的DNA序列中均无内含子,VvSAP13—VvSAP15的DNA序列中有1个内含子,基因结构高度保守。qRT-PCR分析结果表明,在VvSAP家族成员中,VvSAP1和VvSAP9在无处理和各处理下（激素和非生物胁迫）均表达极低或不表达,初步鉴定为假基因。除VvSAP10在400 mmol·L ^-1 NaCl处理下呈下调表达,其余基因均在50 μmol·L ^-1 ABA、100 μmol·L ^-1SA和400 mmol·L ^-1NaCl处理下呈上调表达,其中,VvSAP10—VvSAP14显著响应50 μmol·L ^-1 ABA胁迫,处理24 h后相对表达量分别上调为0 h的37.19、36.63、21.69、58.34和267.35倍;VvSAP8和VvSAP11在NaCl处理4 h后相对表达量最高,分别为0 h的13.16和12.42倍;在4℃低温胁迫下,相对表达量上调最高的是VvSAP15,处理后8 h相对表达量为0 h的35.90倍。 【结论】从葡萄基因组中共鉴定出15个SAP家族成员,初步鉴定得出VvSAP1和VvSAP9为假基因,15个基因分别分布于9条染色体上,并且结构进化高度保守。所有成员均相响应逆境,且均有昼夜节律变化,但该基因家族成员在不同逆境胁迫下的响应程度和在不同时间点的表达模式存在一定的差异。     

莲草直胸跳甲Halloween基因家族鉴定及表达分析

【背景】 莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是世界恶性入侵杂草空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）的专一性生防天敌;莲草直胸跳甲种群动态呈季节性波动趋势,在我国湖南地区其夏季种群数量骤减,导致对空心莲子草的防控效果大大降低。而Halloween基因家族参与昆虫蜕皮激素的合成,影响昆虫生长和繁殖,进而对昆虫种群动态具有一定影响。【目的】 揭示Halloween基因家族在莲草直胸跳甲不同发育时期和不同组织中的表达模式,为进一步探究Halloween基因家族在莲草直胸跳甲中的功能打下基础,进而为生防天敌的扩繁提供新思路。【方法】 通过筛选莲草直胸跳甲卵巢转录组数据并结合生物信息学分析,找到并克隆其体内Halloween基因家族成员;使用NCBI在线分析其保守结构域,利用MEGA6.0对Halloween家族基因进行多序列比对并构建系统发育树;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测各基因在莲草直胸跳甲不同发育时期（卵、幼虫、蛹、雌成虫）和雌成虫不同组织（头、胸、中肠、卵巢、脂肪体）中的表达水平。【结果】 莲草直胸跳甲中存在6个Halloween基因家族成员,分别为AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2、AhCYP314A1和AhCYP315A1;分析发现其均属于P450超家族且具有一定保守性,其中AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2聚为一支,属于P450超家族中CYP2集团,AhCYP302A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1聚为一支,属于线粒体集团;同时,AhCYP306A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在5′端存在跨膜区域。6个Halloween基因在莲草直胸跳甲整个生活史及各个组织中均有不同程度的表达。其中,AhCYP302A1在蛹期第6、7天表达量最高,成虫期表达量整体较低;AhCYP306A1在整个生活史中波动表达,以幼虫期第10天表达量最高;AhCYP307A2在末龄幼虫和化蛹初期的表达量较高;以上3个基因在幼虫期和蛹期的表达量较高。AhCYP307A1在卵期高表达,此后各个时期呈波动下降;AhCYP314A1、AhCYP315A1在成虫期和卵期的表达量相对高于其他两个时期。在头、胸、中肠、卵巢、脂肪体5种组织中,除AhCYP307A1外,Halloween家族其他基因在卵巢中表达量均较高;AhCYP307A1在雌成虫头部显著性高表达。【结论】 克隆并鉴定得到6个莲草直胸跳甲Halloween基因家族成员,其在不同发育时期及不同组织中的表达具有一定差异。通过其表达模式推测Halloween基因家族在莲草直胸跳甲幼虫发育及成虫繁殖过程中可能发挥重要作用,对其幼虫蜕皮与成虫卵巢发育均有一定影响。     

烟草Hsc70-2的克隆及对马铃薯Y病毒侵染烟草的促进作用

【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列（coding sequence,CDS）,利用MEGA 6.0 进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h 其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。     

大丽轮枝菌木糖苷酶基因的鉴定及基于HIGS技术的功能分析

【目的】 从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）中鉴定木糖苷酶基因,研究其与大丽轮枝菌致病力的关系,为解析大丽轮枝菌致病分子机制提供理论依据,同时为制定更好的棉花黄萎病防治策略提供科学依据。【方法】 利用生物信息学方法从大丽轮枝菌基因组数据库中鉴定全部木糖苷酶基因,并对基因编码蛋白的结构域、基因的染色体定位及进化关系等进行分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测木糖苷酶基因在不同抗/感棉花品种根系分泌物培养0、6、12、24和48 h大丽轮枝菌中的表达量。利用寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术对木糖苷酶基因VdxyL3在大丽轮枝菌侵染过程中的功能进行初步分析。将VdxyL3的目标片段转化棉花,采用伤根法接种大丽轮枝菌Vd991,观察转化植株的表型,调查病情指数,同时利用qRT-PCR技术对植株中真菌生物量和VdxyL3的表达量进行检测。【结果】 利用生物信息学方法从大丽轮枝菌中查找出13个木糖苷酶基因（VdxyL1—VdxyL13）,其编码序列长度介于1 461—2 544 bp,蛋白质分子量介于38.78—90.97 kD,理论等电点介于4.67—5.89。结构域和进化树分析发现13个木糖苷酶基因中包括9个糖苷水解酶43家族成员、1个3家族成员和3个31家族成员。染色体定位分析发现13个基因分布在6条染色体上,未形成基因簇。qRT-PCR结果发现选取的6个基因均受到根系分泌物的诱导,在一种或多种根系分泌物中培养6 h或12 h后,表达量均明显升高,然后降低。其中VdxyL3受海岛棉根系分泌物诱导后表达量明显升高,表明该基因的表达明显受海岛棉根系分泌物的诱导。HIGS研究结果表明,接菌14 d和21 d后转化VdxyL3基因干扰片段的棉花发病明显较重,其病情指数（33.3和83.9）明显高于空载体对照（21.7和66.1）。qRT-PCR分析发现转化VdxyL3基因干扰片段的棉花植株茎中VdxyL3的表达量明显低于空载体对照,真菌生物量显著多于对照。【结论】 利用HIGS技术将VdxyL3基因沉默后,棉株的抗病性明显降低,表明VdxyL3在大丽轮枝菌致病及宿主-病原体互作过程中可能发挥着重要的作用。     

P450基因在氯虫苯甲酰胺不同抗性品系小菜蛾中的表达及功能分析

【目的】以十字花科蔬菜害虫小菜蛾（Plutella xylostella）为研究对象,筛选参与小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的主要细胞色素P450解毒基因,为阐明不同抗性水平小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性机理提供依据。【方法】利用叶片药膜法测定不同小菜蛾种群3龄幼虫对氯虫苯甲酰的抗性水平,通过转录组测序、insectbase数据库和小菜蛾基因组数据库筛选得到52个细胞色素P450基因。应用MEGA5.10软件对52个细胞色素P450基因进行进化分析,获得与抗药性密切相关的CYP3和CYP4家族P450基因。利用实时荧光定量PCR方法分析目的基因在小菜蛾室内筛选种群（HZY）和田间抗性种群惠州种群（HZ）、连州种群（LZ）、东升种群（DS）、钟落潭种群（ZLT）中的表达量,选用RNA干扰技术,采用注射法,验证在抗性种群中显著上调表达的CYP6BF1V4在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中的功能。【结果】抗药性测定结果表明,LZ和HZ小菜蛾种群为中等水平抗性,ZLT、DS和HZY小菜蛾种群为高水平抗性。对52个细胞色素P450基因的系统发育树分析发现,小菜蛾拥有10个CYP4家族基因,28个CYP3家族基因,其中2个CYP4家族基因在HZ和HZY种群中的表达量显著高于敏感种群,4个CYP3家族基因表达量与小菜蛾抗性呈正相关,8个基因在中等水平抗性小菜蛾体内的表达量高于在高水平抗性小菜蛾体内的表达量。对田间种群进一步筛选得到6个与小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺密切相关,在不同抗性种群中均上调表达的细胞色素P450基因,其中4个为CYP6家族基因（CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1和CYP6B6）,2个为CYP9家族基因（CYP9G2.1和CYP9G2.2）,以CYP6BF1V4的表达量最高,其在抗性种群中的表达量是在敏感种群中表达量的3.5—6.3倍。RNA干扰结果显示,沉默CYP6BF1V4能够显著提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的敏感性。【结论】CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1、CYP6B6、CYP9G2.1和CYP9G2.2可能在小菜蛾体内协同调控多功能氧化酶的表达,从而加快小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的速度,提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。     

番茄DIR基因家族鉴定及其对非生物胁迫响应的分析

【目的】鉴定番茄DIR基因家族所有成员,并对其基因结构、编码蛋白的理化性质、系统进化、染色体定位、共线性、启动子元件、表达模式、互作转录因子及内源竞争RNA预测等进行了解析,为探究DIR在番茄生长发育和逆境胁迫中的作用提供参考。【方法】采用生物信息学方法,基于全基因组数据对番茄DIR基因家族成员进行鉴定,运用Phytozome、MEME、PlantCARE、opsRNATarget和plantcircnet等在线网站获取染色体位置、保守基序、顺式作用元件、存在互作的转录因子、miRNA和circRNA等信息。利用Mapteace、TBtools、Cytoscape、OmicShare等作图软件及工具绘制染色体定位图、进化树、DIR与转录因子关系图、ceRNA网络等。采用NCBI的基因数据库结合转录组测序及qRT-PCR试验研究DIR基因家族在逆境下的表达情况。【结果】共鉴定到番茄中27个DIR基因,将其命名为SlDIR1—SlDIR27,分别位于12条染色体上,且大部分基因位于染色体末端,其基因结构、基序和结构域相对保守,其中22个SlDIR具有一个外显子的经典结构。番茄DIR基因家族同拟南芥的共线性关系远高于水稻和大豆。基于系统进化关系将27个番茄DIR成员分为3个不同的亚家族。转录组数据表明大部分DIR基因在番茄根部具有较高的表达量。此外,DIR基因的启动子区域含有多个与干旱、低温等非生物胁迫,以及MeJA、ABA、SA等激素诱导相关的顺式作用元件,且预测到与激素、生长发育、非生物胁迫相关的ERF、E2F/DP、MYB等互作转录因子。结合转录组数据分析,分别有5、10、10和13个SlDIR在农药、干旱、盐和冷胁迫后显著上调表达,其中,SlDIR23受到以上4种胁迫的诱导表达,而SlDIR8、SlDIR13和SlDIR20特异性响应冷胁迫的诱导,SlDIR17特异性响应盐胁迫。番茄DIR的ceRNA调控表明,miR-156与靶基因SlDIR8可能共同作用调控番茄的逆境胁迫。【结论】共鉴定出番茄DIR家族基因27个,不均匀地分布在12条染色体上,在根部有较高的表达量。SlDIR1、SlDIR13和SlDIR14等具有MeJA、ABA、SA等激素响应元件,其中,SlDIR6仅具有MeJA元件,SlDIR27仅具有SA响应元件。另外,SlDIR2、SlDIR14、SlDIR23等参与干旱、盐、低温等多种逆境胁迫,其中SlDIR23在不同胁迫处理下均可被激活。此外,DIR基因和转录因子、非编码RNA相互作用,共同参与调控番茄植株的逆境胁迫。     

马流产沙门氏菌的分离鉴定及其微量凝集抗体检测方法的建立与应用

【目的】 对流产马驹组织进行马流产沙门氏菌的分离和鉴定,以分离株制备凝集抗原,旨在建立一种敏感、特异、操作简便和高通量的微量凝集方法,实现对马流产沙门氏菌抗体进行快速检测。【方法】 利用沙门氏菌显色培养基对流产的马驹脏器进行细菌分离,对紫色菌落进行革兰氏染色鉴定;提取细菌全基因组,利用16S rRNA 进行 PCR扩增和测序鉴定,并对菌株进行生化鉴定和血清型鉴定,对病因进行综合诊断。利用分离获得的阳性菌株进行灭活后作为凝集抗原,以马流产沙门氏菌标准阳性血清作为阳性对照,通过反应条件优化,建立微量凝集试验方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了验证。与国家行业标准中的试管凝集试验方法进行对比,同时利用微量凝集对华北和西北各3个地方的共151份血清样品进行检测,并随机选取30份样品,利用微量凝集和试管凝集进行检测,并对两种方法检测的敏感性进行比较分析。【结果】 各流产马驹组织在沙门氏菌显色培养基上划线结果,均可以获得大量紫色目标菌落;革兰氏染色结果表明,分离的菌株为革兰氏阴性短杆菌,16S rRNA测序证实分离株为沙门氏菌属,生化鉴定结果表明,分离的17株菌均符合马流产沙门氏菌的生化特性,但相比上世纪强毒株马流产沙门氏菌C77-1,均不能发酵鼠李糖;血清型鉴定证实分离株均为马流产沙门氏菌,将分离的17株马流产沙门氏菌分别命名为E.S-1—17。因此证实马匹流产均为马流产沙门氏菌感染所致。利用甲醛对E.S-1菌株进行了灭活处理,成功制备了马流产沙门氏菌凝集抗原,并建立了一种快速敏感的微量凝集检测方法,其中优化了最佳反应凝集抗原浓度为4亿/mL。其敏感性比试管凝集高1个滴度,其特异性与其他常见马传染病病原阳性血清无交叉反应,并且具有良好的重复性。利用微量凝集方法,对华北3个疫情区进行检测,阳性率分别为28.6%、42.9%和27.3%,西北3个无疫情区阳性率均为0%。此外,利用两种方法对相同的30份临床血清进行检测,微量凝集和试管凝集方法阳性份数分别为10份和3份,阳性率分别为33.3%和10%。与试管凝集相比,微量凝集诊断敏感性为100%,诊断特异性为74.1%,总体符合率为76.7%。【结论】 分离鉴定获得了17株马流产沙门氏菌,建立了马流产沙门氏菌微量凝集抗体检测方法,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,简便、快速、高通量,可以广泛应用于马属动物中马流产沙门氏菌抗体的检测,是该病诊断及疫苗评估的重要依据之一。     

玉米大斑病菌Septin基因家族的鉴定与表达模式分析

【背景】隔膜蛋白Septin广泛存在于除植物以外所有真核生物中,是高度保守的GTP结合蛋白家族,被认为是继微管、微丝和中间纤维之后的第4种细胞骨架蛋白。病原真菌的Septin蛋白参与细胞极性的确定、形态塑造及与致病相关的形态转换。【目的】鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）Septin基因家族,并进一步分析其在不同发育时期的表达模式,为明确隔膜蛋白Septin与真菌侵染结构发育之间的关系打下基础。【方法】以玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）中6个Septin蛋白的氨基酸序列为探针,在玉米大斑病菌数据库在线Blastp比对和关键词搜索,获得大斑病菌的候选Septin,对其基因结构、理化性质以及跨膜区结构等方面进行生物信息学分析。收集人造疏水介质诱导下侵染结构发育不同时期以及侵染感病寄主叶片不同时间的玉米大斑病菌材料,利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）技术系统分析Septin基因家族在玉米大斑病菌侵染结构形成不同阶段的转录水平。【结果】获得了玉米大斑病菌6个候选Septin,其中4个核心Septin,均含有G1、G3、G4基序,分别将其命名为StSep1、StSep2、StSep3、StSep4。在人造疏水介质诱导下,Septin表达水平均呈上升趋势。StSep1在芽管形成后期表达最活跃,其表达量达到分生孢子时期的25.69倍（P<0.01）,StSep4的表达水平在附着胞发育后期到达高峰,随后表达逐渐下调。该基因家族在病菌侵染寄主叶片过程中的转录水平变化趋势与其在人造疏水介质诱导下的表现趋于一致。StSep1在接种后6 h转录水平极显著上调（P<0.01）,随着时间延长,表达水平下降,StSep4在附着胞形成阶段表达活跃,表达量在接种后18 h达到高峰值,之后表达下调,但仍高于萌发初期。StSep2、StSep3在接种后18 h和24 h表达活跃,高于萌发初期。【结论】玉米大斑病菌基因组中含有4个核心Septin,StSep1和StSep4分别在芽管和附着胞形成时期活跃表达,结果可为进一步明确 Septin的功能及玉米大斑病菌的侵染调控机制提供依据。     

陆地棉BGLU基因家族成员的全基因组鉴定与表达分析

植物BGLU基因在生物和非生物胁迫防御中起着重要作用，利用生物信息学手段对陆地棉（Gossypium hirsutum） BGLU家族成员进行全基因组鉴定，对序列特征、保守域结构、染色体定位、启动子元件等家族特征进行了分析，并进一步结合转录组数据和qRT-PCR分析了BGLU基因家族的病菌胁迫响应模式。结果表明，共鉴定出53个陆地棉BGLU基因，根据系统发育进化关系分为6个亚族，部分基因在病菌胁迫下特异性表达。荧光定量和转录组测序结果表明，GhBGLU5、GhBGLU14、GhBGLU18、GhBGLU26、GhBGLU34在抗病棉花中的表达水平显著高于感病品种，推测这些基因正向调控棉花黄萎病抗性。上述结果为进一步分析棉花BGLU家族基因的功能以及分子机制提供一定的理论基础。     

马铃薯甲虫LdATPaseE调控幼虫蜕皮的分子机制

【目的】研究LdATPaseE通过类胰岛素信号通路影响保幼激素和蜕皮激素通路,调节马铃薯甲虫幼虫化蛹的分子机制。【方法】LdATPaseE cDNA序列通过马铃薯甲虫转录组数据分析和RT-PCR克隆获得;qPCR检测其在马铃薯甲虫各发育阶段,以及四龄幼虫不同组织的相对表达量;采用喂食幼虫dsRNA的方法,分析该基因在马铃薯甲虫幼虫的生长发育过程中的影响,并测定类胰岛素、保幼激素和蜕皮激素通路基因对该基因的表达响应机制。【结果】喂食二龄幼虫dsLdATPaseE后,成功敲低了靶标基因,阻止二龄幼虫的生长,显著增加了二龄幼虫的死亡率。三龄和四龄幼虫喂食dsLdATPaseE-1和dsLdATPaseE-2,在极低浓度下即敲低了靶标基因,阻止了幼虫生长,显著降低马铃薯甲虫幼虫的化蛹率。敲低LdATPaseE还显著升高了LdInR与Ld4EBP的表达量,抑制一个蜕皮激素合成基因的转录,降低20E滴度并降低了一个20E响应基因的表达。敲低LdATPaseE还抑制了一个JH合成酶基因的表达,降低了JH滴度,下调了一个JH早期响应基因的表达量。【结论】沉默LdATPaseE后,其可能通过抑制IIS信号途径,降低20E和JH的滴度、下调20E和JH信号从而影响幼虫生长和发育。     

柑橘U-box基因家族的鉴定及表达分析

目的通过生物信息学分析U-box在柑橘基因组中的分布、结构及进化,研究家族成员在不同组织中的表达特异性以及对非生物胁迫和激素的响应,解析柑橘U-box基因家族的生物学功能。方法 根据已经报道的拟南芥U-box基因,利用Phytozome数据库中的BLASTp工具鉴定柑橘基因组中的U-box基因。采用MEGA6.0、Cello、SMART、GSDS2.0、ExPASy和MapChart等软件构建系统进化树、亚细胞定位预测、预测蛋白的相对分子质量与等电点等理化性质、绘制家族成员Scaffold定位图等,分析U-box基因家族在低温胁迫下表达模式,利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测柑橘U-box基因家族部分成员在NaCl、PEG6000和不同激素处理下的表达情况。结果 从柑橘克里曼丁（Citrus clementina）全基因组中鉴定出56个CcPUBs基因家族成员,可将其分为7类,即U-box only、U-box+ARM-1、U-box+WD40-1、TPR+U-box、Kinase+U-box、U-box+ARM-2和U-box+WD40-2。该家族蛋白理论等电点分布在5.19—9.14,编码的氨基酸数目介于281—1 441;亚细胞定位预测结果显示该基因家族成员位于细胞不同位置,主要位于细胞核或叶绿体,少数位于质膜;聚类分析发现,柑橘U-box与单子叶植物水稻的亲缘关系较远,柑橘中具有相同结构域的成员和拟南芥具有相同结构域的成员聚在一起,表明柑橘U-box成员具有不同生物学功能;Scaffold定位分析发现,56个U-box成员分布在1—9 Scafflod上且呈不均分布。在冷胁迫下的RNA-Seq分析结果表明,U-box基因家族参与植物对冷胁迫的应答,并表现出4种不同的应答模式;从柑橘U-box基因家族的5个不同簇上分别选取1个代表基因进行qRT-PCR,分析结果表明,CcPUB48在金柑的各个组织中均有表达,CcPUB9和CcPUB4主要在茎和花中表达,CcPUB10主要在花、茎和幼果中表达,CcPUB41主要在叶和茎中表达,体现了不同U-box成员的组织特异性的表达差异。CcPUB4、CcPUB10和CcPUB41在NaCl胁迫下表达均上调,而CcPUB48在盐胁迫下的表达无明显变化。CcPUB4在Na₂CO₃处理下表达明显上调,与NaCl处理存在一致的表达趋势,而CaCl₂处理下的表达与NaCl处理下的表达趋势却存在差异。在PEG6000的处理条件下,CcPUB4的表达量呈现先上升后下降的趋势,CcPUB9、CcPUB41和CcPUB48在PEG6000的处理下无明显变化。在赤霉素（GA₃）处理下,CcPUB4在3 h时明显上调,在生长素（IAA）和脱落酸（ABA）下呈现无规律变化,CcPUB10在ABA处理下表达量表现出逐渐上升。结论 从柑橘克里曼丁全基因组上鉴定出56个U-box基因成员,各成员均含有U-box保守结构域,并位于细胞的不同位置。U-box基因家族参与植物对冷胁迫的应答并表现出4种不同的应答模式,在NaCl、PEG6000和激素处理下,CcPUB4和CcPUB10有不同程度的响应,而CcPUB9、CcPUB41和CcPUB48响应不明显或未响应。     

慢病毒介导shRNA干扰MAT2A与MAT2B基因抑制猪肌内脂肪细胞分化

【目的】腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT)在ATP的作用下,催化生成体内重要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。通过构建慢病毒介导的pLenti-H1干扰载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶MAT2A和MAT2B对猪肌内脂肪细胞分化的影响。【方法】无菌条件下采集3—7日龄小猪背最长肌,采用差速贴壁法分离猪肌内脂肪细胞。根据GenBank中猪MAT2A基因序列（Accession No.NM_001167650.1）和MAT2B基因序列（Accession No. NM_001142832.1）,获得其CDS序列。利用Invitrogen 公司在线软件BLOCK-iTTM RNAi Designer分别设计shRNA靶序列, 将合成的单链寡核苷酸退火形成双链,与经过Bam H I和Xho I (TaKaRa) 双酶切后的pLenti-Hl载体连接,转化,并提取质粒进行酶切和测序鉴定。采用X-tremeGENE-HP DNA转染试剂与测序成功的重组质粒以及包装质粒（CMV-Δ8.9和CMV-VSVG）共转染293T细胞,48 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并进行滴度测定。在猪原代脂肪细胞密度达到70%—80%时,侵染病毒;细胞密度融合时诱导分化。提取分化第8天的猪肌内脂肪细胞的RNA,按照反转录试剂盒操作说明进行反转录,合成cDNA第一链。采用primer primer 5软件设计MAT2A、MAT2B、PPARγ、aP2、CEBP/α、β-actin基因的定量引物,实时定量和Western blot试验检测MAT2A和MAT2B基因的干扰效率。油红O染色和实时定量鉴定MAT2A和MAT2B基因对猪肌内脂肪脂质积累的影响。【结果】酶切及测序证明重组慢病毒载体pLenti-Hl-MAT2A/MAT2B构建成功;包装的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B病毒滴度分别为6.7×10 ⁷和7×10 ⁷ pfu/mL,侵染肌内脂肪细胞72 h后,可出现90%的绿色荧光蛋白(GFP),表明所包装的病毒可满足侵染猪前体肌内脂肪细胞需要。实时定量结果显示其显著抑制了MAT2A和MAT2B的mRNA水平表达,其干扰效率分别在70%和60%以上;进一步采用Western blot试验及蛋白分析表明,干扰MAT2A基因后,MAT2A蛋白表达水平降低40%左右,差异达到极显著水平(P<0.01);干扰MAT2B基因后,MAT2B蛋白表达水平降低25%左右,差异达到显著水平(P<0.05)。油红O染色和吸光度定量结果显示,与sh-scramble对照组相比,干扰MAT2A和MAT2B基因后,脂滴聚积能力显著抑制猪肌内脂肪细胞脂质积累。实时定量结果显示,干扰MAT2A和MAT2B基因抑制成脂标志基因PPARγ,aP 2及CEBP/α的表达。 【结论】成功构建了猪MAT2A和MAT2B基因的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B干扰载体。获得的重组慢病毒感染细胞后,能有效降低猪肌内前体脂肪细胞内MAT2A和MAT2B基因的mRNA和蛋白水平表达;进一步试验证明,干扰MAT2A及MAT2B基因后,显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质积累以及成脂关键基因表达。     

表皮蛋白基因TcCP14.6和TcLCPA3A参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性形成

【目的】 表皮蛋白是昆虫表皮重要的结构物质,大量研究已经证实表皮蛋白基因参与介导昆虫抗药性形成。以赤拟谷盗（Tribolium castaneum）为研究对象,解析表皮蛋白基因TcCP14.6（cuticle protein CP14.6）和TcLCPA3A（larval cuticle protein A3A）在昆虫磷化氢抗性形成过程中的作用。【方法】 采用联合国粮农组织（FAO）推荐的磷化氢熏蒸方法对采自5个省份赤拟谷盗的磷化氢抗性水平进行测定。基于赤拟谷盗基因组数据获得TcCP14.6和TcLCPA3A的cDNA序列,利用在线生物信息学分析软件预测其编码的氨基酸序列、信号肽和保守结构域。分别提取赤拟谷盗不同组织（头、胸、腹的表皮、翅、足、肠道、马氏管和脂肪体）、不同磷化氢抗性水平以及磷化氢胁迫后试虫的总RNA。以TcRPS和TcRPL为内参基因,运用RT-qPCR技术分析TcCP14.6和TcLCPA3A在赤拟谷盗不同组织、不同磷化氢抗性水平和药剂胁迫下的表达模式。最后,通过RNA干扰技术结合生物测定方法分析TcCP14.6和TcLCPA3A与赤拟谷盗磷化氢抗性的关系。【结果】 生物测定结果表明,江苏（JS,RR=1.7）和云南（YN,RR=3.0）种群对磷化氢保持敏感,湖南种群（HN,RR=20.2）表现为中等抗性,四川（SC,RR=395.4）和广东（GD, RR=862.7）种群表现为极高抗。序列分析结果表明TcCP14.6和TcLCPA3A蛋白均包含信号肽和保守的几丁质结合域。RT-qPCR结果显示,TcCP14.6和TcLCPA3A均在赤拟谷盗表皮组织中高表达,而在内部器官（脂肪体、肠道、马氏管）中的表达量相对较低。此外,TcCP14.6表达量随磷化氢抗性水平的增加呈上调趋势,而TcLCPA3A表达量则呈下降趋势;赤拟谷盗经磷化氢熏蒸处理6 h,TcCP14.6和TcLCPA3A的表达量分别呈现上调和下调趋势。注射dsRNA分别干扰抗性（GD）和敏感（YN）种群两个基因的表达后再用LC₃₀的磷化氢浓度处理试虫。与对照相比,TcCP14.6基因沉默后赤拟谷盗的死亡率显著升高,而TcLCPA3A基因沉默后试虫死亡率显著下降。【结论】 表皮蛋白基因TcCP14.6和TcLCPA3A参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性。     

捻转血矛线虫Hc-FAR-4蛋白的表达特性及其与配体结合能力分析

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生在牛羊等反刍动物的皱胃中,引起的捻转血矛线虫病在我国呈全国性流行。文章通过研究脂肪酸与视黄醇结合相关蛋白Hc-FAR-4的表达特性及配体结合能力,以了解其在捻转血矛线虫生长、发育、繁殖过程中的作用。【方法】对Hc-far-4进行克隆、并且构建原核表达载体pET-30a-Hc-far-4,pET-30a-Hc-far-4重组质粒经过PCR与双酶切鉴定准确无误之后转化到E. coli BL21感受态细胞中,用0.1 mmol·L ^-1IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)进行重组蛋白的诱导表达。收集重组蛋白rHc-FAR-4,利用荧光分析法,研究rHc-FAR-4蛋白与DAUDA、视黄醇、油酸的结合能力。配体结合试验是依据荧光物质retinol与脂肪酸类似物DAUDA在极性和非极性溶液中,在某一波长的激发光激发下,所发出的荧光光谱随之变化的特性,判断rHc-FAR-4蛋白是否具有与DAUDA、retinol结合的能力。再在体系中加入非荧光长链脂肪酸油酸,根据荧光光谱的变化情况判定油酸能否分别与DAUDA、retinol竞争目的蛋白的脂肪酸结合位点,间接说明目的蛋白能否与非荧光脂肪酸油酸结合。同时制备鼠源多克隆抗体,利用ELISA技术检验免疫后小鼠的抗体效价,抗体效价合适即可收集小鼠血清。收集的血清用于免疫组织荧光（IHF）试验,探究Hc-FAR-4的表达部位,从而推测其功能。该试验过程为：对捻转血矛线虫进行石蜡包埋,石蜡切片,抗原修复,3%的BSA 于4℃封闭过夜,自制鼠源多克隆抗体作为一抗孵育1 h; Alexa Fluor? 488 nm羊抗鼠IgG作为二抗避光孵育1 h,DAPI染色30 min,激光共聚焦显微镜检查染色情况。利用荧光定量PCR技术分析Hc-far-4在捻转血矛线虫各个主要阶段的表达特性。【结果】成功克隆目的基因Hc-far-4,测序结果与Sanger数据库中捻转血矛线虫far-4基因序列（>HCISE00908800.t1）相似度为 99.9%;重组质粒 pET-30a-Hc-far-4在E. coli BL21中成功表达,在诱导8 h后达到峰值。经过ELISA检测,结果显示制备的鼠源多克隆抗体效价达到1﹕1 024 000—1﹕2 048 000,可用于后续试验。Western Blot鉴定结果显示rHc-FAR-4重组蛋白带有His标签,并且条带大小为25 kD,结果符合预期。制备的鼠源多克隆抗体经过Western Blot鉴定,能够与天然Hc-FAR-4 蛋白结合,说明该抗体可用于IHF试验。配体结合试验结果表明 rHc-FAR-4蛋白具有结合脂肪酸与视黄醇的能力。荧光定量PCR分析表明,Hc-far-4在四期幼虫中的转录水平最高;IHF试验表明,Hc-FAR-4主要表达在捻转血矛线虫的肠壁、性腺中。综上推测Hc-FAR-4蛋白主要在寄生生活阶段参与了转运脂肪酸与视黄醇,为捻转血矛线虫的生长发育与生殖提供营养物质。【结论】捻转血矛线虫 FAR-4 蛋白能够结合脂肪酸类似物DAUDA和视黄醇,但是与油酸的结合能力较弱,主要表达在肠壁,在性腺、角皮中也有少量表达,其基因在进行营寄生生活阶段时表达量达到峰值。