热应激对淮南麻鸭血清生化指标及肝脏与心脏HSP70 mRNA表达的影响

试验旨在探讨热应激对淮南麻鸭血清生化指标及肝脏与心脏热休克蛋白HSP70 mRNA表达的影响。将60只40日龄雌性淮南麻鸭随机分成6组,每组10只,分别为对照组及热应激2、4、6、8、10 h处理组,将试鸭于(20±1)℃温度下适应性饲养7 d,于第8天开始,对照组仍置于(20±1)℃温度下,试验组迅速升温至(40±1)℃并分别施以2、4、6、8、10 h的热应激处理,试验结束后试鸭全部屠宰取样进行血清生化指标测定和检测肝脏、心脏组织热应激蛋白HSP70 mRNA表达水平。结果表明:热应激显著降低淮南麻鸭血清总蛋白、白蛋白和球蛋白浓度(P0.05),遵循二次曲线回归模式;血清谷丙转氨酶随着热应激处理时间的增加显著升高(P0.05),并表现出显著的线性趋势;肌酸激酶和谷草转氨酶活性随着热应激处理时间的增加显著升高(P0.05),遵循二次曲线回归模式;肝脏与心脏HSP70 m RNA表达水平呈先升高后降低的趋势,并分别于6 h和4 h后达到峰值。以上表明,在一定的热应激强度范围内,淮南麻鸭通过调节机体的代谢及HSP70表达量来响应热应激的影响。     

财政支持对农业科技成果转化的作用

<正> 随着市场经济的建立和农业的发展,加快科技成果转化已成为农业部门面临的重要课题。目前,我国科技成果转化工作仍是弱项,是农业发展的“瓶颈”,据资料统计,我国每年推出的科技成果推广率只有1/3,推广的普及率不到1/3,大部分被滞留在试验室或科技档案室。科技成果转化率低直接阻碍了农业的发展。为此,各级各部门不断探     

过表达MAT2A基因促进猪肌内脂肪细胞分化的研究

本研究通过构建腺病毒介导的体外超表达载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶2A(methionine adenosyltransferase 2A,MAT2A)基因在猪肌内脂肪细胞分化中的作用。根据GenBank中猪MAT2A基因mRNA序列(登录号:NM_001167650.1)设计引物,提取猪脂肪组织细胞总RNA并反转录获得cDNA,以此为模板进行PCR扩增并连接到pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中,对重组质粒pAd-MAT2A进行测序鉴定;pAd-MAT2A载体经PacⅠ限制酶酶切线性化,经质粒大片段回收纯化后转染293A细胞进行病毒包装;采用实时荧光定量PCR检测MAT2A基因表达情况,并提取蛋白进行Western blotting分析,取分化第8天的细胞进行油红O染色。结果表明,穿梭载体pAdTrack-CMV-MAT2A构建成功,并能与骨架载体pAdEasy-1实现同源重组;腺病毒载体pAd-MAT2A转染293A细胞后,病毒滴度达到1E+6PFU/mL,可满足侵染猪肌内脂肪细胞的需要。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,MAT2A基因mRNA和蛋白水平均显著上调。油红O染色结果显示,过表达MAT2A基因可促进猪肌内脂肪细胞内脂滴聚积。结果表明,腺病毒介导的MAT2A基因过表达在猪肌内脂肪细胞中呈上调趋势,MAT2A基因可促进脂质积累。     

过表达MAT2A基因促进猪肌内脂肪细胞分化的研究

本研究通过构建腺病毒介导的体外超表达载体，探究腺苷甲硫氨酸转移酶2A（methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）基因在猪肌内脂肪细胞分化中的作用。根据GenBank中猪MAT2A基因mRNA序列（登录号：NM_001167650.1）设计引物，提取猪脂肪组织细胞总RNA并反转录获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增并连接到pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中，对重组质粒pAd-MAT2A进行测序鉴定；pAd-MAT2A载体经PacⅠ限制酶酶切线性化，经质粒大片段回收纯化后转染293A细胞进行病毒包装；采用实时荧光定量PCR检测MAT2A基因表达情况，并提取蛋白进行Western blotting分析，取分化第8天的细胞进行油红O染色。结果表明，穿梭载体pAdTrack-CMV-MAT2A构建成功，并能与骨架载体pAdEasy-1实现同源重组；腺病毒载体pAd-MAT2A转染293A细胞后，病毒滴度达到1E+6 PFU/mL，可满足侵染猪肌内脂肪细胞的需要。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示，MAT2A基因mRNA和蛋白水平均显著上调。油红O染色结果显示，过表达MAT2A基因可促进猪肌内脂肪细胞内脂滴聚积。结果表明，腺病毒介导的MAT2A基因过表达在猪肌内脂肪细胞中呈上调趋势，MAT2A基因可促进脂质积累。     

热休克蛋白70生物学功能及在家禽组织中的表达

热休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP)是生物细胞在受到热应激等应激源刺激后所产生一类多肽类蛋白质,其中HSP70是HSP家族中最重要、最保守且表达最广泛的蛋白之一,其普遍存在于各种生物体之中。现对HSP70调节细胞凋亡、增强细胞耐热、细胞抗氧化、机体免疫和分子伴侣等生物学功能进行综述,并对其分子调控机制及在家禽组织中的表达水平作了阐述,为进一步探讨HSP70调控家禽的热应激反应及分子机制奠定理论基础。     

复合中药凝胶剂的制备

本试验以天葵子为主药,与蒲公英、苦参、白鲜皮3种中药联合使用制备复方中药凝胶剂。采用水提法提取中药的有效成分,以卡波姆-940、主药、甘油、氮酮的用量为因素,采用正交试验设计,优选复合中药凝胶剂的最佳配比,并根据2015版中国药典关于凝胶剂的质量要求,对本试验所制备的复合中药凝胶剂进行质量检查。结果显示,1.5%卡波姆940,15%主药,10%甘油,1.5%氮酮为本试验中复合中药凝胶剂的最佳组合方案。药效学试验表明,本试验所制得的凝胶剂对治疗皮肤炎症具有一定的治疗效果。     

慢病毒介导shRNA干扰MAT2A与MAT2B基因抑制猪肌内脂肪细胞分化

【目的】腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT)在ATP的作用下,催化生成体内重要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。通过构建慢病毒介导的pLenti-H1干扰载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶MAT2A和MAT2B对猪肌内脂肪细胞分化的影响。【方法】无菌条件下采集3—7日龄小猪背最长肌,采用差速贴壁法分离猪肌内脂肪细胞。根据GenBank中猪MAT2A基因序列（Accession No.NM_001167650.1）和MAT2B基因序列（Accession No. NM_001142832.1）,获得其CDS序列。利用Invitrogen 公司在线软件BLOCK-iTTM RNAi Designer分别设计shRNA靶序列, 将合成的单链寡核苷酸退火形成双链,与经过Bam H I和Xho I (TaKaRa) 双酶切后的pLenti-Hl载体连接,转化,并提取质粒进行酶切和测序鉴定。采用X-tremeGENE-HP DNA转染试剂与测序成功的重组质粒以及包装质粒（CMV-Δ8.9和CMV-VSVG）共转染293T细胞,48 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并进行滴度测定。在猪原代脂肪细胞密度达到70%—80%时,侵染病毒;细胞密度融合时诱导分化。提取分化第8天的猪肌内脂肪细胞的RNA,按照反转录试剂盒操作说明进行反转录,合成cDNA第一链。采用primer primer 5软件设计MAT2A、MAT2B、PPARγ、aP2、CEBP/α、β-actin基因的定量引物,实时定量和Western blot试验检测MAT2A和MAT2B基因的干扰效率。油红O染色和实时定量鉴定MAT2A和MAT2B基因对猪肌内脂肪脂质积累的影响。【结果】酶切及测序证明重组慢病毒载体pLenti-Hl-MAT2A/MAT2B构建成功;包装的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B病毒滴度分别为6.7×10 ⁷和7×10 ⁷ pfu/mL,侵染肌内脂肪细胞72 h后,可出现90%的绿色荧光蛋白(GFP),表明所包装的病毒可满足侵染猪前体肌内脂肪细胞需要。实时定量结果显示其显著抑制了MAT2A和MAT2B的mRNA水平表达,其干扰效率分别在70%和60%以上;进一步采用Western blot试验及蛋白分析表明,干扰MAT2A基因后,MAT2A蛋白表达水平降低40%左右,差异达到极显著水平(P<0.01);干扰MAT2B基因后,MAT2B蛋白表达水平降低25%左右,差异达到显著水平(P<0.05)。油红O染色和吸光度定量结果显示,与sh-scramble对照组相比,干扰MAT2A和MAT2B基因后,脂滴聚积能力显著抑制猪肌内脂肪细胞脂质积累。实时定量结果显示,干扰MAT2A和MAT2B基因抑制成脂标志基因PPARγ,aP 2及CEBP/α的表达。 【结论】成功构建了猪MAT2A和MAT2B基因的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B干扰载体。获得的重组慢病毒感染细胞后,能有效降低猪肌内前体脂肪细胞内MAT2A和MAT2B基因的mRNA和蛋白水平表达;进一步试验证明,干扰MAT2A及MAT2B基因后,显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质积累以及成脂关键基因表达。