马铃薯甲虫RNA干扰高效致死基因的筛选

【目的】基于备选基因RNA干扰后的致死效果评价,筛选出高效致死基因。【方法】通过在赤拟谷盗中已的报导和相似性搜索获得马铃薯甲虫致死基因Ldpp1alpha-96a、LdRpt3、Ldalpha snap、LdSrp54k、LdRpn6、LdRop、LdGawky、Ldshi、Ldcact、Ldinr-a,以及阳性对照基因LdATPaseA和LdATPaseE,构建dsRNA表达载体,经饲喂马铃薯甲虫二龄幼虫不同浓度的dsRNA,分析对幼虫的20%取食剂量AD₂₀、化蛹中量PD₅₀和幼虫7 d致死中量LD₅₀ ,经分析和评估,筛选出高效致死基因。【结果】12个基因的dsRNA对马铃薯甲虫幼虫的 AD₂₀ 在1.18±0.10(μg / mL)~ 61.07±10.17(μg / mL);PD₅₀ 在0.06 ±0.01(μg / mL)~ 31.20 ±1.89(μg / mL);LD₅₀ 在1.39±0.13(μg / mL)~ 228.13±6.72(μg / mL)。其中 AD₂₀ 最高与最低的基因分别为Ldinr-a、LdRpn6 ;PD₅₀ 最高与最低的基因分别为Ldinr-a、LdGawky;LD₀ 最高与最低的基因分别为Ldinr-a、Ldsrp54k。【结论】12个基因的dsRNA对马铃薯甲虫幼虫均有一定的抑制取食、抑制化蛹及致死活性。其致死活性随浓度增高而增大,表现出剂量依赖效应,与对照组存在显著差异。通过综合比较AD₂₀和LD₅₀,Ldalpha snap、LdRpn6、LdSrp54k、LdRpt3个基因的毒力较ATPaseE和ATPaseA更强,具有较高的生物活性。提出并推荐AD₂₀和LD₅₀是评价备选基因dsRNA对幼虫致死效果的关键指标。     

马铃薯甲虫田间定殖过程及其种群消长动态

【目的】研究马铃薯甲虫田间定殖与种群消长动态,为马铃薯的科学防治提供参考和依据。【方法】系统调查乌鲁木齐市西山农牧场和三坪农场马铃薯生长期,田间马铃薯甲虫种群消长规律,分析比较田间不同空间位置寄主植物上马铃薯甲虫种群数量,确定定殖时间与迁移过程。【结果】西山农牧场和三坪农场马铃薯甲虫定殖规律为:寄主作物田外马铃薯甲虫成虫出土后,最初迁移抵达寄主田块边缘,随后逐步向田块中心扩散,直至覆盖整个田块;马铃薯甲虫种群数量与定殖时间呈负相关,定殖时间越早,马铃薯甲虫种群数量越大;马铃薯甲虫种群数量与定殖点距离有一定的关系,在马铃薯甲虫定殖的早期,马铃薯甲虫与定殖距离呈负相关,定殖距离越大,马铃薯甲虫种群数量越小;随后两者的相关性逐渐降低,在后期两者呈正相关。【结论】马铃薯甲虫的定殖时间和定殖位置均会对其种群数量产生影响,应在田块边缘区域开展越冬代马铃薯甲虫成虫的早期监测,有效确定轮作田块内马铃薯甲虫种群的定殖与迁移过程。     

盐胁迫下盐穗木miR393b与预测靶基因HcTIR1的表达及相关性

【目的】研究盐胁迫下盐穗木生长素通路中miR393b和预测的靶基因TIR1的表达模式和相关性。【方法】采用生物信息学方法预测盐穗木miR393b的靶基因;通过qRT-PCR方法检测盐胁迫下盐穗木miR393b及预测靶基因HcTIR1(transport inhibitor response1)的相对表达模式,并分析其相关性。【结果】miR393b成熟体在不同植物种中高度保守;盐穗木miR393b预测的靶基因为TIR1;盐胁迫处理,盐穗木同化枝中两基因响应高盐胁迫,并具有一定的负相关性。【结论】盐穗木miR393b和预测的靶基因响应高盐胁迫,二者具有一定的负相关。该结果为进一步探讨盐穗木miR393b与预测靶基因TIR1的生物学功能奠定基础。     

陆地棉细胞色素P450超家族基因GhCYP85A2-1的克隆与功能分析

【目的】研究细胞色素P450超家族CYP85A亚家族基因在棉花株高发育中的生物学功能,为陆地棉株高分子育种提供理论依据和基因资源。【方法】 采用同源克隆方法,从陆地棉中克隆CYP85A家族基因GhCYP85A2-1,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing, VIGS)构建GhCYP85A2-1基因沉默载体,利用qRT-PCR技术检测侵染棉花幼苗的基因表达量。【结果】 GhCYP85A2-1基因沉默植株的株高显著降低,基因的表达量也显著下降。【结论】 GhCYP85A2-1基因在棉花株高发育过程中起到重要调控作用。     

海岛棉GbHCT10基因的克隆与表达分析

【目的】研究海岛棉(Gossypium barbadense)GbHCT10基因在棉纤维发育中的作用。【方法】 以海岛棉品种新海21号纤维发育第5 d的样本作为材料,根据海岛棉GbHCT10基因序列设计一对引物,利用RT-PCR技术从中克隆GbHCT10核苷酸序列。利用生物信息学方法分析GbHCT10基因序列。【结果】 采用实时荧光定量PCR技术分析海岛棉GbHCT10基因在新海21号棉花开花后不同时期中表达量差异,该基因具有长度为1 248 bp的开放阅读框,编码415个氨基酸,预测蛋白质分子量为45.13 kD,等电点为6.01。海岛棉GbHCT10基因的表达随棉纤维发育变化而变化,在开花后第5和第10 d时表达量较高,第25 d表达量最低,总体表达量呈现波动状态。【结论】 新海21号GbHCT10基因与树棉HCT基因在同一分支,有较近亲缘关系。     

小麦叶绿素酸酯a氧化酶(TaCAO)基因的克隆与表达分析

【目的】研究弱光环境下叶绿素酸酯a氧化酶(TaCAO)的表达水平变化,分析叶绿素合成途径对于弱光环境的响应。【方法】利用同源克隆,由小麦品种新冬20号克隆TaCAO并分析其序列。使用半定量PCR方法分析900、1 800、3 600和7 200 lx光照强度下TaCAO表达量。【结果】该基因ORF长度为1 653 bp,编码蛋白大小为62.12 kD,包含550个氨基酸残基,含有叶绿素转运肽和Rieske_RO_Alpha_CAO结构域,还存在一个Rieske铁硫配位中心和铁结合位点,随着光照强度的减弱,TaCAO表达量呈现上升的趋势。【结论】克隆获得的TaCAO长度为1 653 bp,具有完整的CAO活性,TaCAO的相对表达量与光照强度呈反比关系。     

香梨优斑螟脂肪酸Δ9去饱和酶基因序列及不同虫态的表达分析

【目的】研究Δ9去饱和酶基因特性及其在不同虫态下的表达,研究EpFAD9基因功能及潜在应用提供数据,为该香梨优玫玉暝、饱和脂肪酸积累中的作用提供参考。【方法】采用生物信息学软件鉴定、分析和预测Δ9去饱和酶(EpFAD9)的核苷酸和氨基酸序列,研究蛋白质结构和功能,并利用qRT-PCR方法测定△9去饱和酶基因在不同虫态下的表达水平。【结果】EpFAD9基因开放阅读框由1 056 bp组成,含352个氨基酸,起始密码子ATG位于获得序列的第1 280碱基上,终止密码子TAA位于该序列第2 338碱基。推测该蛋白无信号肽,共4个跨膜结构域,整体表现为亲水性蛋白,主要在内质网中发挥生物学作用。EpFAD9基因在幼虫期表达量较高,分别是成虫期和蛹期的17.75和29.58倍。【结论】EpFAD9基因基因在香梨优斑螟不同虫态下存在表达差异,在幼虫体内的表达量最高,成虫和蛹期的表达很低,尤其是虫蛹,其表达量更低于成虫,虫蛹和成虫状态下的香梨优斑螟对低温抵抗能力都低于幼虫。     

CRISPR-Cas9技术敲除甜瓜eIF4E基因表达载体的构建

【目的】构建甜瓜eIF4E基因的CRISPR-Cas9植物基因编辑系统的gRNA 表达载体。为研究eIF4E基因功能奠定基础。【方法】以新疆主栽甜瓜皇后为材料,在eIF4E基因的第一个外显子区设计gRNA引物,以载体pP1C.4为模板,扩增获得sgRNA克隆框,使用EcoR I、Xba I双酶切pP1C.4载体,利用DNA重组酶构建重组载体pP1C.4-eIF4E。【结果】经菌落PCR检测和测序,gRNA 已经成功连接到植物基因敲除载体pP1C.4。【结论】构建了植物基因敲除载体pP1C.4-eIF4E,pP1C.4-eIF4E能对eIF4E基因进行定向编辑。     

玉米钙依赖蛋白激酶38(ZmCDPK38)的生物信息学及表达特性分析

【目的】 研究ZmCDPK38与其它物种中同源基因之间的遗传进化关系,通过与亲缘关系较近且功能已知的同源基因比较,对ZmCDPK38的功能进行理论预判。确定ZmCDPK38基因在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【方法】 生物信息学分析使用在线分析工具及MEGAX软件;基因表达分析采用Real-time PCR。【结果】 ZmCDPK38与ZmCDPK28及高粱等6个其它植物物种的CDPK的氨基酸序列具有较高的一致性,遗传进化关系上较近。氨基酸序列包含4个结构域,具有CDPKs家族氨基酸的典型特征,Ser/Thr蛋白激酶结构域相对保守。ZmCDPK38基因在叶片中的表达量最高,其次是茎部、根、雄穗及雌穗;受盐胁迫及干旱胁迫诱导,ZmCDPK38基因的表达水平显著上升,在低温和高温胁迫条件下基因表达未见明显变化。【结论】 ZmCDPK38基因作为CDPK家族成员,在蛋白序列和结构上具备典型的CDPK家族成员特征;ZmCDPK38基因响应干旱胁迫与盐胁迫,可能在干旱应答与盐胁迫应答反应中发挥一定的功能。     

E-β-法尼烯对十一星瓢虫和龟纹瓢虫嗅觉选择行为及取食率的影响

【目的】研究十一星瓢虫和龟纹瓢虫对[反]-β-法尼烯[(E)-β-farnesene](以下简称EβF)后的行为反应,为调控利用天敌治理棉蚜提供理论依据。【方法】于室内条件下,利用嗅觉仪测定不同浓度EβF对十一星瓢虫和龟纹瓢虫成虫和3龄幼虫的嗅觉行为选择,以及在棉花植株上释放不同浓度EβF对十一星瓢虫和龟纹瓢虫成虫和3龄幼虫对棉蚜取食选择的影响。【结果】EβF剂量为20和40 μL/mL时,可引起十一星瓢虫与龟纹瓢虫成虫和3龄幼虫明显的嗅觉选择行为反应;EβF处理剂量为10、20、40 μL/mL时,十一星瓢虫与龟纹瓢虫的成虫和3龄幼虫的取食选择率均明显高于对照。【结论】适宜的EβF剂量可引起2种瓢虫成虫和3龄幼虫明显的选择行为,EβF对自然天敌具有良好的生态调控作用。     

海岛棉GbPR10基因的克隆及其抗枯萎病表达分析

【目的】为棉花抗枯萎病分子育种的基因来源提供依据。【方法】根据前期转录组测序和抗病表达数据,从棉花EST数据库中筛选出抗枯萎病有关的基因(登录号为CD486053)序列,在NCBI搜索与该基因同源性为94%的海岛棉抗病相关PR10基因(登录号为AY588276)并设计引物,从枯萎病接菌的抗病海岛棉材料“06-146”克隆一个海岛棉同源基因,命名为GbPR10基因。进行生物信息学和在枯萎病菌、乙烯、水杨酸处理下基因表达量分析。【结果】GbPR10基因有480 bp的ORF序列,编码159个氨基酸。该蛋白序列中具有PR10蛋白特有的Bet-v1结构域和改变的甘氨酸环P-Loop(GXGGXG)。蛋白质序列同源比对表明该蛋白与其他生物PR10蛋白有较高的一致性。亚细胞定位预测表明GbPR10分布于细胞质。qRT-PCR表达分析表明,GbPR10基因在不同抗病海岛棉品种的不同组织上表达量不均匀而较高于感病海岛棉品种;在乙烯和水杨酸处理的1对抗/感海岛棉根系中,抗病品种出现先上调后下调趋势,感病材料后期诱导表达,抗病品种的表达量几乎高于感病品种。【结论】GbPR10基因在海岛棉抗枯萎病信号途径中起重要作用。     

扁桃AcDHN1基因的克隆及原核表达分析

【目的】 克隆与分析扁桃脱水素基因,为研究脱水素基因在扁桃抗逆机制中发挥的功能提供参考。【方法】 以新疆栽培的扁桃品种‘纸皮’叶片为材料,通过PCR技术克隆扁桃AcDHN1基因并对该基因进行原核表达分析,构建原核表达载体,在大肠杆菌进行表达。【结果】 克隆得到了一个脱水素基因,命名为AcDHN1,GenBank登陆号为KT949395,该基因全长924 bp、编码308个氨基酸的多肽,为稳定的亲水性蛋白,属于Y₂K_n型脱水素,推测蛋白分子质量为32.4 kD,亚细胞定位于细胞核中。将该基因与原核表达载体连接构建重组质粒pET-AcDHN1,然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明,该蛋白分子量的大小约为52.7 kD,与预期长度一致。【结论】 对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果显示,该基因在IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导3 h表达量最佳。     

饲粮α-亚麻酸水平对意大利蜜蜂工蜂幼虫生理机能的影响

【目的】探究饲粮中α-亚麻酸的添加水平对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）工蜂幼虫抗氧化活性和免疫能力的影响。【方法】移取1日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫1 200只,随机分为5组,每组5个重复,每个重复48只;其中1组为对照组,饲喂不添加α-亚麻酸的基础饲粮,4组为处理组,分别饲喂α-亚麻酸添加水平为0.02%、0.04%、0.06%和0.08%的饲粮。按照室内蜜蜂幼虫饲养方法,将1日龄幼虫用移虫针移至温度适宜的加入200 μL饲粮的24孔细胞培养板内,培养板置于恒温培养箱中（温度33℃,相对湿度55%）,试验期间每天更换饲粮。饲养至第6天末或第7天初,幼虫开始有直立或排便现象时,将幼虫转移至提前铺好灭菌纸的24孔细胞培养板内准备化蛹。从饲养第1天开始,每天检查并记录幼虫和蛹的死亡数量,并将死亡个体及时移除,直至未死亡的蛹全部羽化新蜂,记录成功化蛹和羽化新蜂个体数量,统计幼虫化蛹率和羽化率。各组分别取5、6和7日龄幼虫测定抗氧化、免疫、脂质代谢指标及相关基因表达量。【结果】饲粮中α-亚麻酸的添加水平为0.02%和0.04%时,化蛹率和羽化率显著高于与其他处理组（P＜0.05）,而工蜂幼虫血淋巴中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）含量显著低于对照组,高密度脂蛋白（HDL）的含量却显著高于对照组（P＜0.05）。饲粮中α-亚麻酸的添加水平为0.04%时,工蜂幼虫超氧化物歧化酶（T-SOD）的活性较对照组显著增加,丙二醛（MDA）的含量显著降低（P＜0.05）。饲粮中α-亚麻酸的添加水平为0.02%、0.04%和0.06%时,6日龄工蜂幼虫的溶菌酶（lysozyme）和酚氧化酶（PO）活性显著高于对照组（P＜0.05）。饲粮中α-亚麻酸添加水平为0.04%时,6日龄工蜂幼虫脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性显著低于对照组（P＜0.05）。饲粮中α-亚麻酸添加水平为0.04%时,5和7日龄工蜂幼虫lysozyme和PO相对表达量显著高于对照组,但饲粮中α-亚麻酸添加水平为0.08%时,lysozyme相对表达量会显著降低（P＜0.05）。【结论】α-亚麻酸对意大利蜜蜂工蜂幼虫抗氧化活性和免疫能力有一定影响,幼虫饲粮中α-亚麻酸适宜添加水平为0.02%—0.04%。