鸡白痢沙门氏菌活的非可培养状态相关基因ybbB和rh1B的鉴定

为鉴定细菌活的非可培养状态(VBNC)下的转录基因,本研究采用液体LB培养基在4℃条件下诱导鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum) CVCC578株进入VBNC状态,并利用mRNA差异显示RT-PCR技术(DDRT-PCR)分析S.pullorum VBNC状态与正常状态所表达的差异基因.结果表明,在S.pullorum的VBNC状态下克隆得到两个转录基因片段,分别为422 bp和573 bp.序列分析表明:422bp的cDNA片段与不同沙门氏菌株的tRNA硒尿核苷合成酶(tRNA 2-selenouridine synthase)的ybbB基因的核苷酸和氨基酸同源性均为99％;573bp的cDNA片段则与不同菌株S.pullorum的ATP依赖性的RNA解旋酶基因(rh1B)的核苷酸同源性为95％～100％,氨基酸同源性为98％以上.在VBNC状态下这两个转录基因的发现,将为S.pullorum的VBNC机理研究奠定基础.     

柞蚕核糖体蛋白基因S3a的克隆及表达分析

核糖体蛋白在蛋白质的生物合成、细胞的代谢与凋亡、机体免疫、信号转导等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)核糖体蛋白基因S3a的开放阅读框(ORF),ORF序列长795bp,编码264个氨基酸。序列比对表明,柞蚕S3a蛋白与其它10个物种S3a蛋白的相似性介于72%～99%之间,其中与柳蚕(Actias selene)S3a蛋白的相似性最高。用RT-PCR方法分析该基因在柞蚕幼虫组织中的表达情况,结果显示柞蚕S3a基因在柞蚕幼虫的血液、中肠、丝腺和脂肪体组织中均有表达,且转录水平无显著差异。SDS-PAGE和Westernblotting检测显示柞蚕S3a基因在大肠杆菌中获得了正确表达。     

赣南地区柑橘黄龙病菌遗传多样性分析

为探究赣南地区柑橘黄龙病菌的遗传多样性。从赣南16个县市区采集32个具典型柑橘黄龙病症状的脐橙样品，运用PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性长度多态性分析)技术研究了柑橘黄龙病菌16S rDNA序列、16S/23S rDNA间隔区序列和核糖体蛋白基因的遗传多态性；并对三个基因片段进行测序，分析其序列的碱基含量、转换与颠换、同源性、核苷酸遗传距离和系统进化特征。RFLP结果表明：赣南16个县市区柑橘黄龙病菌XbaⅠ酶切图谱均与亚洲韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas）的一致；进一步分析显示，三个基因片段各自之间的RFLP指纹图谱一致，并未表现多态性。序列分析结果表明：32个分离物三个基因片段各自的同源性均在98%~100%，与CLas的同源性最大，且与CLas的遗传距离最小。系统进化树展示赣南地区柑橘黄龙病菌与CLas处于同一分支，结合酶切图谱、序列同源性及系统进化分析结果表明： 赣南地区柑橘黄龙病菌均为CLas。结论：赣南地区柑橘黄龙病菌的16S rDNA序列、16S/23S rDNA间隔区序列和核糖体蛋白基因未表现遗传多样性，表明赣南地区柑橘黄龙病菌间遗传多样性不显著。 关键词：柑橘黄龙病；16S rDNA序列；核糖体蛋白基因；16S/23S rDNA间隔区；RFLP；序列分析     

山东蚕区桑黄化型萎缩病病原物的分子鉴定

以采自山东省宁阳市桑园的桑黄化型萎缩病发病植株叶脉组织为材料,通过PCR扩增植原体16S rRNA基因及延伸因子基因(tuf)和核糖体蛋白基因(rp),分别得到大小约为1.4、0.8和1.2 kb的目的片段并测定序列。以该病原物的16S rRNA基因与GanBank中相关的植原体16S rRNA基因序列构建系统发育树并进行RFLP分析,结果显示该病原物属于翠菊黄化组的16SⅠr-B亚组,与翠菊黄化组16SⅠr-B亚组典型成员的同源性为99.9%。进一步对延伸因子基因和核糖体蛋白基因构建系统发育树并做RFLP分析,结果显示该病原物与翠菊黄化组的tuⅠf-B亚组典型成员和rpⅠ-B亚组典型成员的同源性分别达到99.6%、99.9%。由此在3个基因水平确定该植原体的分类地位属于16SrⅠ-B、tuⅠf-B和rpⅠ-B亚组。     

基于ITS基因分析蛇源曼氏迭宫绦虫种系发育关系

为了开展曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni)种系发育分析,本试验基于18S rRNA和5.8S rRNA基因保守区设计引物用于扩增包含18S rRNA、5.8S rRNA及核糖体内部转录间隔1区(ITS-1)的靶片段,对蛇体内分离的绦虫进行基因组DNA提取,然后采用PCR方法扩增目的基因,将所得序列进行测序比对并构建进化树分析。PCR结果显示,扩增片段大小为737 bp,序列经分析发现包括18S rRNA 17 bp,5.8S rRNA 421 bp,ITS-1片段为304 bp。同源性分析显示,其与猬迭宫绦虫同源性最高,高达86%;遗传进化树表明,其与猬迭宫绦虫广州株(FJ886754.1)最为接近,与微小膜壳绦虫(AF461124.1)关系最远。综上所述,本次分离的绦虫为曼氏迭宫绦虫,ITS-1基因可作为良好的分类工具区别不同种的迭宫绦虫。     

松鼠12S rRNA基因的克隆及序列分析

为探讨松鼠的系统发育关系,对东北松鼠的12S rRNA基因进行了克隆测序,序列长度为453 bp。分析表明,东北松鼠的12S rRNA基因与欧亚红松鼠的同源性为99%,与日本松鼠的同源性为98%,与日本小鼯鼠的同源性为91%,与西伯利亚花栗鼠的同源性为88%。     

黑颈鹤源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

对黑颈鹤病原菌进行快速鉴定及毒力因子分析。采用16S rRNA序列分析法鉴定黑颈鹤病原菌,其毒力基因分别用大肠杆菌的irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR检测,并将扩增出来的irp2基因序列与Genbank~（TM）相应序列进行同源性分析。分离菌株鉴定为大肠埃希氏菌,鉴定结果与生化检测结果一致,分离菌携带irp2毒力基因,这从毒力试验得到证实,其序列与与Genbank~（TM）上发表的HPI irp2基因序列同源性高达98%以上。采用16S rRNA序列分析法可以对黑颈鹤大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,黑颈鹤源性大肠杆菌携带有irp2毒力基因。     

湖南省珍稀雉类组织滴虫核糖体18S rRNA系统进化分析

为分析珍稀雉类组织滴虫核糖体18S rRNA序列遗传变异情况,并利用18S rRNA序列分析组织滴虫与其他原虫的种群遗传关系,应用PCR技术扩增珍稀雉类异刺线虫体内组织滴虫核糖体18S rRNA基因序列,并进行测序与分析。结果表明:异刺线虫雄虫与异刺线虫雌虫体内均含有火鸡组织滴虫,且9个组织滴虫分离株核糖体18S rRNA序列片段大小基本一致,约为590 bp,各分离株之间核糖体18S rRNA序列同源性均高于99.4%,与Gen Bank中收录其他原虫相应序列同源性均低于66.8%;通过建立NJ系统发育树,9个组织滴虫分离株与Gen Bank收录的火鸡组织滴虫位于同一分支,得到明显的鉴定。核糖体18S rRNA序列种内相对保守,但种间差异明显,可作为火鸡组织滴虫的种间遗传变异研究的分子遗传标记。     

华南虎源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

从患病华南虎分离病原菌,进行快速鉴定,同时以大肠杆菌16S rRNA基因的通用引物和irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR扩增、测序,并将扩增出来的irp2、iucD、iss基因序列与Genbank相应序列进行同源性分析。测序鉴定为大肠埃希氏菌,与传统细菌鉴定方法结果相一致,分离菌携带irp2、iucD、iss毒力基因,从毒力试验得到证实。其序列与Genbank上发表的iucD、iss基因序列同源性分别高达98%、99%,而irp2基因序列的同源性仅为48%。采用16S rRNA基因序列分析法可以对华南虎大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,华南虎源性大肠杆菌同时携带有irp2、iucD、iss 3个毒力基因,可能与其致病性有关系。     

柚木虱体内“Candidatus Liberibacter asiaticus”多基因位点的分子鉴定

利用与柑橘黄龙病相关的韧皮部杆菌（“Candidatus Liberibacter sp.”,简称“Ca. L. sp.”）16S rRNA基因、β-操纵子核糖体蛋白基因、外膜蛋白基因以及16S-23S rRNA间隔转录区基因位点的4对特异性引物,对采自云南瑞丽柠檬园的柚木虱（Psylla citrisuga）DNA样品进行PCR扩增,将扩增产物进行纯化、回收,连接至PEASY-T3载体并转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1,筛选阳性克隆进行测序,利用NCBI Blastn软件以及MEGA5.05软件对所克隆的序列进行同源性分析与聚类分析。结果表明：柚木虱体内韧皮部杆菌亚洲种在这4个基因位点与已报道的“Ca. L. asiaticus” psy62株系全基因组相应基因位点的同源率均为99%。本研究证实柚木虱能够携带韧皮部杆菌亚洲种,是该菌新的昆虫宿主。     

应用23S rRNA对禽波氏杆菌分离株的进化分析

通过PCR扩增分离保存的8株禽波氏杆菌、3株兔支气管败血波氏杆菌及1株猪支气管败血波氏杆菌菌株的23S rRNA基因的片段(710bp),分别克隆到载体pMD18-T后测序。利用BLAST工具进行同源性搜索;用DNAStar分析软件进行同源核苷酸序列的多重比较分析并构建禽波氏杆菌菌株的系统生物进化树。结果显示,8株禽波氏杆菌核苷酸序列之间同源性为99.2%～99.7%,与GenBank中收录的NC_010645株禽波氏杆菌核苷酸序列同源性为92.4%～92.5%,与兔支气管败血波氏杆菌和猪支气管败血波氏杆菌的核苷酸序列同源性均为98.5%～99.2%。国内分离的禽波氏杆菌菌株和支气管败血波氏杆菌菌株均与国外分离菌株在遗传基因上有一定的差异。结果表明,23S rRNA序列分析可以作为鉴定禽波氏杆菌的一种快速简便的方法。     

引发仔猪水样腹泻的多重耐药、高致病性大肠埃希菌的分离与鉴定

近来,长春地区多个养猪场发生高致病性、高死亡率的仔猪水样腹泻,腹泻仔猪经多种药物反复治疗,均无疗效。试验从发病仔猪肠壁内膜分离到2株大肠埃希菌(Escherichia coli),经鉴定,分离菌株为多耐药、高致病性菌株。将分离株进行生化试验及其16S rRNA序列的克隆、测序,并与GenBank中的序列进行对比,结果显示,分离菌株16S rRNA与GenBank登录的大肠埃希菌序列同源性达99%。动物回归试验结果显示,该大肠埃希菌能引起仔猪水样腹泻。药敏试验结果显示,常用治疗大肠杆菌病的药物如庆大霉素、氧氟沙星、环丙沙星等均对其无效。     

新疆某牛场大肠杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

为了调查新疆某规模化奶牛场犊牛腹泻的原因并确定病原,无菌采集15份腹泻犊牛粪样进行病原的分离培养,采用形态学观察、生化试验、血清学和致病性分析等方法鉴定分离菌株,利用大肠杆菌16S rRNA通用引物进行基因序列扩增并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的其他菌株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树并进行分析,同时对分离菌株的黏附性基因进行鉴定。结果从15份样品中分离获得2株分离菌株;试验显示,分离株均发酵葡萄糖,MR试验、吲哚和甲基红试验呈阳性,硫化氢、氧化酶、DNA酶、VP试验呈阴性。2株分离菌株血清型均为O78,且均具有致病性。药敏试验显示,分离菌株均对环丙沙星、卡那霉素、氟哌酸、庆大霉素、磺胺甲唑、头孢哌酮、壮观霉素、多黏菌素B、呋喃妥因敏感。分离株16S rRNA基因序列与大肠杆菌菌株NF738(GenBank登录号:MT649856)同源性为≥99.7%,且处于同一大分支。经PCR鉴定,分离菌株具有K88黏附性基因。本研究结果证实了引起新疆某规模化奶牛场犊牛腹泻的病原为致病性产肠毒素型大肠杆菌。     

奇异变形杆菌分离株23S rRNA序列分析

通过PCR反应扩增7株鸡奇异变形杆菌和1株兔奇异变形杆菌的23SrRNA基因片段(1045bp),经克隆测序,用DNA Star分析软件将所获得的序列与GenBank中收录的奇异变形杆菌、普通变形杆菌以及其他相近属的23S rRNA基因序列进行同源性比较,并由此构建奇异变形杆菌系统进化发生树。结果表示,本实验室保存的7株鸡奇异变形杆菌核苷酸序列与GenBank中收录的奇异变形杆菌核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与兔奇异变形杆菌核苷酸序列同源性为98.8%～99.3%,与普通变形杆菌的核苷酸序列同源性为95.4%～96.2%,而与其他相近属同源性只有92.9%～93.4%。结果表明,23S rRNA基因序列分析可以作为鉴定奇异变形杆菌的一种快速、简便的方法。     

低浓度冰醋酸诱导的鸡源大肠杆菌"活的非可培养状态"

利用LIVE/DEAD试剂盒染色法,流式细胞仪检测法,以及RT-PCR方法检测了经低浓度冰醋酸作用的鸡源大肠杆菌活细胞,并对其进行了复苏。结果表明,当可培养菌数降为零时,LIVE/DEAD试剂盒染色法及流式细胞仪检测法均能检测出较高数量的活菌数;RT-PCR法也能检测到活细胞信号分子-mRNA,并扩增出“活的非可培养状态”（VBNC）细菌的cDNA片段。这些均显示细菌已进入VBNC,且在吐温80作用下又恢复为可培养状态,从而证实大肠杆菌具有“VBNC”状态。     

牦牛大肠杆菌的分离鉴定及系统发育分析

本试验旨在研究牦牛源大肠杆菌的遗传进化关系,明确其与人和其他动物大肠杆菌的亲缘关系。采集来源于四川省甘孜州、阿坝州的60份临床健康成年牦牛肛门棉拭子样本,接种于麦康凯琼脂培养基上进行细菌的分离培养,通过常规形态学、培养特性、生化特征和16S rRNA PCR检测的研究,确定49株为大肠杆菌。对其中9株牦牛源大肠杆菌进行16S rRNA克隆、测序,经系统发育分析发现牦牛菌株组内同源性为98.8%~99.9%,与GenBank中其他菌株的同源性为94.0%~100%。结果表明,牦牛源大肠杆菌与牛源菌株的遗传距离最近,与羊源菌株的遗传距离最远,与人、猪、鸭、鸡源菌株的遗传距离较近,其中有2株菌与人肠出血性大肠杆菌(EHEC)O₁₅₇∶H₇和志贺氏菌聚为一支,从遗传进化的关系看其有可能成为人类的潜在病原菌。     

致鹅卵黄性腹膜炎E.coli fimFGH基因序列分析

为研究致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌(E.coli) fimFGH基因的变异情况,本实验根据GenBank中登录的序列设计引物,PCR扩增了3株致鹩卵黄性腹膜炎性E.coli E0238、E0239、E0240 Ⅰ型菌毛的fimFGH基因并测序.序列比对分析结果表明,3株细菌的fimF、fimG和fimH基因及其所编码的蛋白...     

广西猪源产肠毒素大肠杆菌毒力因子及多重耐药性分析

本研究旨在探究广西某猪场可能存在的病原菌及其致病的主要原因。试验采用细菌分离纯化、形态学鉴定、生长曲线测定、生化分析及药敏试验等进行细菌的分离鉴定,应用PCR技术对菌株16S rRNA、毒力基因及耐药基因进行检测。结果表明,该由病料分离的菌株为无芽孢、有菌毛、两端钝圆的粗短杆状的革兰氏阴性菌,其繁殖能力强、生长迅速,疑似为大肠杆菌。16S rRNA扩增结果显示,出现大小为1 474 bp的条带,测序结果表明其与大肠杆菌的同源性可达99%。该菌株对31种常见抗菌药物表现出极强的耐药性,对庆大霉素、替米考星、四环素、恩诺沙星、青霉素、林可霉素、磺胺甲噁唑等均呈现较高的耐药水平,耐药率高达87.10%(27/32),仅对阿米卡星、黏菌素2种药物敏感。毒力因子检测共鉴定致病岛FyuA、肠毒素STb和LT及黏附素F41和K88共5种毒力因子,检出率为35.70%(5/14)。扩增出β-内酰胺酶类bla_TEM和bla_OXA、四环素类tet(A)、磺胺类Sul2、氨基糖苷类aadA1和aac(3′)-Ⅱa、喹诺酮类GyrA、GyrB和ParC及氯霉素floR共10种耐药基因,检出率为66.70%(10/15),且耐药基因的检出与耐药表型呈正相关。综上,该菌株含多种毒力因子,耐药型复杂,多重耐药性情况严重,需采取相应的预防措施,防止蔓延和传播。