基于诱变和抗性突变的多杀霉素高产菌株的选育

为提高菌株发酵液中多杀霉素产量,本试验利用常温常压等离子体(ARTP)诱变、紫外(UV)诱变和抗性突变技术处理刺糖多孢菌株DS0322-3,结合高通量筛选和摇瓶发酵选育多杀霉素高产菌株。结果显示,通过ARTP诱变和UV诱变育种,筛选获得384株突变菌株,其中有9株突变菌株的效价较原始菌株增加10%以上,且1株效价较原始菌株增加20%以上,经过ARTP诱变30 s,得到的突变菌株AR1019-4效价为547.78 mg/L,较原始菌株增加了21.88%。以ARTP诱变得到的高产突变菌株AR1019-4为出发菌株,通过抗性突变筛选技术筛选获得1 152株突变株,其中13株突变菌株的效价较出发菌株增加10%以上,且2株效价较出发菌株增加15%以上,在0.5 mg/L的氯霉素平板上得到的突变菌株Chl 1215-5效价为637.12 mg/L,较出发菌株增加了16.31%;12 mg/L的庆大霉素抗性突变筛选到了突变菌株Gen 1207-8,效价为597.59 mg/L,该菌株的Spinosyn D组分由10%～15%增加至30%～35%左右,经遗传稳定性试验验证,突变菌株Chl1215-5和Gen1207-8可稳定遗传。试验结果表明ARTP诱变、紫外诱变和抗生素突变技术对选育多杀霉素高产菌株具有重要意义。     

富铬酿酒酵母的单倍体原生质体复合诱变选育

对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)单倍体菌株SY8的原生质体进行紫外线(UV)和微波(MW)复合诱变,获得1株高抗性突变菌株SY8-4-29,其Cr3+抗性水平为20 mmol/L,是出发菌株(5 mmol/L)的4倍,其铬含量为6.211 mg/kg,约是出发菌株(1.265 mg/kg)的5倍,拮抗紫外线6、0Co辐射和清除羟基自由基的能力显著增强。50世代培养结果表明,其遗传稳定性在95%以上。     

嗜热乳链球菌胞外多糖高产菌株的选育

以1株嗜热乳链球菌S19(EPS产量为448 mg/L)为出发菌株,进行了紫外线(UV)、硫酸二乙酯(DES)的复合诱变。将108个/ml的菌悬液用功率20 W的紫外线距离25 cm照射20 min后,再利用15μg/ml的DES乙醇溶液(0.5 g/ml)处理30 min,效果较理想,得到EPS产量高达965 mg/L的突变株,且具有良好的遗传稳定性。     

产β-甘露聚糖酶菌株育种及培养基优化

利用实验室筛选保藏最高酶活为10.7 U/mL的白腐真菌作为出发菌株,进行紫外诱变育种及培养基优化,以期提高菌株产β-甘露聚糖酶能力.结果表明,紫外诱变条件为孢子悬液浓度106～107个/mL,诱变时间10 min,此条件下的孢子致死率达78％,获得了13株正向突变株,经6代遗传稳定性试验证明UV-2突变株酶活最高,遗传稳定性最强,比出发菌株酶活提高了2.075倍.通过单因素试验确定了该突变株的最佳碳源、氮源分别为魔芋粉和硝酸铵,对酶活影响较大的无机盐为磷酸二氢钾.通过正交试验,确定了最佳产酶培养基为魔芋粉4.0 g/L、NH4NO3 5.0 g/L、KH2PO4 5.0 g/L、NaCl 1.0 g/L、MgSO4·7H2O1.0 g/L,在此条件下测得甘露聚糖酶最大酶活为46.17 U/mL,比优化前提高了40.3％.     

常压室温等离子体(ARTP)诱变快速选育对亚洲玉米螟高毒的苏云金芽孢杆菌突变株

采用常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380菌株,选育对亚洲玉米螟高毒力突变株。经过4轮的ARTP诱变、镜检及摇瓶发酵筛选得到的突变株Bt-NBIC-380-18-407,其摇瓶发酵液对玉米螟二龄幼虫效价达到6 835 IU/μL,杀虫晶体蛋白含量6.3 mg/mL。该突变株的效价较初始菌株提高了25.7%,杀虫晶体蛋白含量提高了18.9%。经过5次传代,证实该突变株具有良好的遗传稳定性。     

常压室温等离子体快速诱变筛选高产纤维素酶生产菌株

以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain)JC-1为出发菌株,采用常压室温等离子体诱变系统(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)进行诱变,根据刚果红透明圈大小以及96孔板高通量筛选法筛选出产纤维素酶活力高的突变菌株。选育出一株遗传稳定性良好的突变菌株,命名为T-16菌株。结果表明:该菌株产纤维素酶活力达到1.759 U/m L,比出发菌株提高了41.8%。对突变菌株T-16进行发酵特性研究,发现突变菌株T-16比出发菌株产酶时间提前了8 h。     

江苏省句容市灰霉病菌对啶酰菌胺的抗药性

为明确江苏省句容市灰霉病菌(Botrytis cinerea)对啶酰菌胺的抗药性水平,本研究2年间采集灰霉病菌122株,采用区分计量法测定其对啶酰菌胺的敏感性,并采用孢子萌发法测定菌株的抑制中浓度(EC_(50)),以确定菌株的抗药性表型,通过对药剂靶标基因(琥珀酸脱氢酶基因)sdh B、sdh C和sdh D的序列分析,确定抗药性分子机理。结果表明,总抗性菌株占42.60%,不同取样点间灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性频率有较大差异。本研究根据抗性菌株与敏感菌株EC_(50)的比值(RF)把菌株敏感性表型划分为敏感菌株(RF2,S)、敏感性下降菌株(2≤RF3,RS)、低抗菌株(3≤RF10,LR)、中抗菌株(10≤RF100,MR)和高抗菌株(RF≥100,HR),其EC_(50)平均值分别为0.044 8 mg/L、0.131 7 mg/L、0.326 1 mg/L、1.255 5 mg/L和11.170 7 mg/L。对9株敏感菌株和所有抗性菌株抗性靶标基因的测序结果进行比对,在所测定的敏感菌株的3个亚基(sdh B、sdh C和sdh D)均未发现氨基酸取代,与敏感菌株相比,所有抗性菌株的sdh B基因在第272位密码子发现有2种类型的突变,即H272R和H272Y突变,sdh C和sdh D基因未发生突变。     

丁烯基多杀菌素高产菌株的诱变选育及培养基优化

利用不同剂量的亚硝基胍(nitroso-guanidin,简称NTG)对须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)ASAGF58诱变处理不同时间,通过96孔板发酵培养结合生物检测进行高通量筛选;利用单因素试验和正交试验,对高产菌株产丁烯基多杀菌素的发酵培养基进行碳源、氮源优化。结果表明,从5 mg/mL NTG诱变处理50 min的突变株中,筛选出1株遗传稳定且丁烯基多杀菌素产量明显提高的突变菌株2-G4,该菌株丁烯基多杀菌素发酵产量比出发菌株提高86.7%;优化获得的最佳培养基配方为100.00 g/L葡萄糖、50.00 g/L糊精、20.00 g/L玉米浆干粉、80.00 g/L棉籽蛋白、5.00 g/L NaCl、5.00 g/L CaCO_3、1.02 g/L MgSO_4·7H_2O,pH值为7.2。2-G4菌株在该优化培养基中的丁烯基多杀菌素产量比优化前提高52.1%。     

水产动物源气单胞菌喹诺酮类耐药与PMQR基因、QRDR突变相关性分析

为了解PMQR基因、QRDR突变与气单胞菌喹诺酮类耐药相关性,以116株水产源气单胞菌为研究对象,采用PCR法检测PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr)并分析QRDR靶基因gyrA、parC突变情况,用微量二倍稀释法测定萘啶酸(NAL)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)的最小抑菌浓度(MIC)值。结果表明:116株气单胞菌中,有18株(15.52%)菌株携带PMQR基因,其中8株(6.90%)携带qnrS2基因,9株(7.76%)携带aac(6′)-Ib-cr基因,1株同时携带qnrS2、aac(6′)-Ib-cr基因,未检测到qnrA,qnrB和qepA基因;56株(48.28%)菌株发生QRDR靶位点突变,主要突变方式为GyrA:Ser~(83)Ile和GyrA:Ser~(83)Ile+ParC:Ser~(87)Ile;对NAL、CIP及ENR耐药率分别为47.41%、12.07%及11.21%;7株仅携带qnrS2基因菌株未发生QRDR突变,对喹诺酮类药物敏感性略下降,NAL、CIP及ENR的MIC值分别小于4.00、0.50和1.00mg/L;10株携带aac(6′)-Ib-cr基因的菌株均发生QRDR突变并对NAL表现耐药,MIC值均128.00mg/L,其中8株对CIP和ENR表现耐药,MIC值均≥4.00mg/L;发生gyrA单突变或gyrA和parC双突变菌株均对NAL表现耐药,MIC值均≥64.00mg/L,CIP和ENR的MIC值有的4.00mg/L,有的≥4.00mg/L。综上,QRDR靶基因突变可影响水产动物源气单胞菌对萘啶酸的药物敏感性,而气单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药可能与PMQR和QRDR协同作用有关。     

高产洛蒙真菌素的洛蒙德链霉菌S015的诱变筛选

通过洛蒙真菌素的结构类似物吩嗪-1-羧酸(Phenzine-1-catboxylic acid,PCA)对1株洛蒙真菌素的产生菌——洛蒙德链霉菌野生菌株S015诱变,筛选到突变株S015-P34,其洛蒙真菌素的产量达到了(106.0±4.4)mg/L,是野生株的3.2倍;通过作用于核糖体的抗生素利福平和庆大霉素分别对菌株S015诱变,筛选到突变株S015-R6和S015-G11,洛蒙真菌素的产量分别达到了(103.4±0.1)mg/L和(81.2±2.5)mg/L,是野生株的3.2倍和2.5倍;最后,结合PCA和利福平的复合抗性筛选,得到突变株S015-R646,洛蒙真菌素的产量为(168.0±2.2)mg/L,是野生型菌株的5.1倍;又通过添加0.1 mmol/LFeCl_3发酵培养,使突变株S015-R646的洛蒙真菌素产量达到(258.7±5.7)mg/L。这试验结果可为其他产吩嗪类活性物质的链霉菌的高产菌株的诱变筛选提供参考。     

具广谱抗菌活性桔青霉PA-33的诱变育种

为增强产抗生素桔青霉(Penicillium citrinum) PA-33的抗菌活性,提高所产抗生素的产量。以桔青霉PA-33菌株为出发菌株,以大肠杆菌为指示菌,分别采用紫外诱变、紫外-Li Cl诱变、紫外-亚硝酸复合诱变、微波诱变以及微波-超声波-3%硫酸二乙酯(diethyl sulfate,简称DES)复合诱变等技术对桔青霉PA-33菌株孢子悬液进行诱变,筛选出抗菌活性增强的突变菌株,并测定突变菌株的遗传稳定性。筛选得到5株高产抗生素突变菌株Li-1、N-25、H-14、WB-6、D-11,它们的抗菌活性提高率分别为39. 51%、39. 19%、40. 26%、32. 29%、20. 83%;其中突变菌株Li-1、H-14、N-25遗传稳定性较好,突变菌株WB-6、D-11遗传稳定性相对较差。桔青霉PA-33诱变育种效果明显,抗菌活性明显增强,能为其进一步工业化应用提供基础和依据。     

产CLA植物乳杆菌P8的离子束诱变与筛选

本实验以植物乳杆菌P8为出发菌株,采用N+离子注入的方法进行诱变处理,注入能量为50keV,注入剂量为30、50、70、901、10、1301、50、1701、90×2.6×1013N+/cm2。结果显示,菌体的存活率随离子注入剂量的增加呈"马鞍型"曲线,"鞍脊"出现在70×2.6×1013N+/cm2～110×2.6×1013N+/cm2之间,此时菌体的存活率在21%～50%之间。综合考虑存活率、总突变率和突变幅度等因素,推荐90×2.6×1013N+/cm2作为离子注入植物乳杆菌P8的适宜诱变剂量。此菌株经N+离子束诱变,得到产共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)正突变菌株共36株,负突变菌株共66株,其中最高产CLA正突变菌株CLA浓度为0.2751mg/ml,转化率为27.51%。最低产CLA负突变株CLA浓度为0.0330mg/ml,转化率为3.30%。菌株的遗传稳定性正在进一步鉴定,若可以稳定遗传,将为研究植物乳杆菌P8产CLA的分子机理和生产出营养价值更高的保健食品奠定基础。     

复合诱变选育丙酮丁醇梭菌发酵玉米秸秆水解液

[目的]提高丙酮丁醇梭菌CICC8012产丁醇能力。[方法]采用紫外线和甲基磺酸乙酯（EMS）复合诱变选育丙酮丁醇梭菌CICC8012。[结果]紫外辐照120 s,5%EMS处理60 m in条件下,筛选得到1株遗传稳定性良好的高产突变株M-31,其在葡萄糖培养基中总溶剂产量10.39 g/L,丁醇产量6.55 g/L,较出发菌株分别提高了16.48%和20.62%。对M-31玉米秸秆水解液发酵培养基进行优化,得到最优工艺组合：初始水解糖浓度为80 g/L,（NH4）2SO43 g/L,KH2PO40.6 g/L,MgSO4.7H2O 0.4 g/L,FeSO4.7H2O 15 mg/L,并选择亚硫酸盐法对秸秆水解液进行脱毒,丁醇和总溶剂产量分别达到5.19和8.27 g/L,较优化前分别提高了55.39%和55.74%。[结论]得到的高产突变株较出发菌株丁醇产量更高、更适合于生物质发酵。     

一株产油酵母菌摇瓶产油发酵条件的优化

以产油酵母突变菌株Y1m为试验菌株,通过单因素试验对突变菌株Y1m发酵条件进行了优化。结果表明,该突变菌株最适发酵产脂条件为发酵时间5 d,100 mL摇瓶装液量20 mL,发酵液初始pH 6.0,种子液接种量为10%,温度27℃,产脂培养基中硫酸锌含量为0.5 mg/L,氯化钙含量为0.3 g/L,氯化铁含量为0.5 mg/L,硫酸铜含量为0.05 mg/L时,突变菌株Y1m在上述条件下油脂产量最高。     

亚硝基胍诱变丙酸杆菌选育高产抑菌物质菌株

[目的]提高丙酸杆菌代谢物的抑菌活性,为薛氏丙酸杆菌代谢物的工业化生产奠定基础。[方法]以实验室保藏的薛氏丙酸杆菌H1310为出发菌株,采用亚硝基胍(NTG)进行诱变处理,待突变菌株长出后采用双层平板筛选法进行筛选,而后通过深层液体发酵对筛选到的菌株进行复筛。[结果]当最优的NTG诱变浓度为0.3 mg/m L时,致死率为90.69%。采用双层平板法,从3 564株菌落中挑选出87株突变株,进一步进行复筛,获得一株突变菌株,其代谢物抑菌活性达(28.30±2.47)AU/m L,比出发菌株提高43.87%。[结论]确定了丙酸杆菌NTG诱变选育的试验方法,获得一株抑菌活性高的遗传性能稳定的菌株。     

洛伐他汀高产菌株的选育

为了提高红曲霉发酵生产洛伐他汀的能力,分别采用紫外线、亚硝酸、硫酸二乙酯对出发菌株(Monascus sp.)进行诱变处理。结果表明:3种诱变剂对Monascus sp.的诱变效果有较大差异,其中紫外线诱变效果最好,硫酸二乙酯次之,亚硝酸最差。通过筛选,得到2株高产突变株,分别命名为:Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8,其产量分别为0.239 mg/m L、0.223 mg/m L,比原始菌株分别提高了42.3%、32.7%。遗传稳定试验结果显示,Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8遗传性能较稳定,可应用于生产。     

富钼酿酒酵母菌株的选育及其生物学功能研究

以酿酒酵母单倍体菌株SY10作为出发菌株,采用紫外线、微波复合诱变处理其原生质体,选育出1株对钼高抗性突变株SY10-186-8,其抗性水平为400 mmol/L,是出发菌株的5.71倍。生物学功能结果表明,与出发菌株相比,该突变株拮抗紫外线、清除羟基自由基和超氧自由基能力以及黄嘌呤氧化酶活性均显著增强。经50世代培养,该突变菌株遗传稳定性良好,达90%以上。     

耐高温蛋白酶高产菌株的选育

本研究采用紫外线诱变育种的方法,选育耐高温蛋白酶高产菌株。试验结果表明,经过牛奶平板初筛和酶活测定复筛,得到菌株A2的酶活为525. 56U/m L,与初始菌株相比,其酶活提高了34. 26%。菌株A2经过5次代传酶活力在519. 12～538. 23U/m L之间,具有较好的遗传稳定性。     

农用抗生素瑞拉菌素高产菌株的选育

以委内瑞拉链霉菌秦岭变种RL-1(Streptomycesvenezuelae var.qinlingensis RL-1)为出发菌株,应用链霉素抗性筛选法,将经过紫外线诱变处理后的孢子涂布于含有链霉素最小抑制浓度(10μg/mL)的培养基平板上,获得146株链霉素抗性突变株,并从中筛选到对稻瘟病菌拮抗性能为出发菌株的3.77倍、且遗传稳定性良好的高产菌株Glx-93.进一步生测试验表明,突变株Glx-93对5种病原真菌和4种病原细菌的抗菌活性比原始菌株有显著提高.     

放线菌SL-5链霉素耐药突变菌株的分离、活性筛选及发酵优化研究

【目的】为新型抗生素的开发研究提供有效途径。【方法】对放线菌SL-5在链霉素不同浓度下的耐药突变菌株进行分离和活性筛选,并采用单因素和正交试验对活性菌株进行发酵优化。【结果】从无活性放线菌SL-5的耐药菌株中得到1株活性突变菌株str-14,室内生测结果表明,其发酵液对蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的抑菌圈直径为17.5 mm。通过单因素和正交试验,确定该菌株的最佳摇瓶发酵培养基配方为:小米10 g/L,葡萄糖20g/L,酵母粉2 g/L,蛋白胨7 g/L,混合VB1.5 mg/L,NaCl 2.5 g/L,CaCO32.0 g/L。最佳培养条件为:初始pH为8.0,装液量70 mL(250 mL三角瓶),180 r/min培养7 d。【结论】通过引入链霉素耐药性突变获得抑菌活性物质,是创制新型抗生素的一条可行之路。