基于诱变和抗性突变的多杀霉素高产菌株的选育

为提高菌株发酵液中多杀霉素产量,本试验利用常温常压等离子体(ARTP)诱变、紫外(UV)诱变和抗性突变技术处理刺糖多孢菌株DS0322-3,结合高通量筛选和摇瓶发酵选育多杀霉素高产菌株。结果显示,通过ARTP诱变和UV诱变育种,筛选获得384株突变菌株,其中有9株突变菌株的效价较原始菌株增加10%以上,且1株效价较原始菌株增加20%以上,经过ARTP诱变30 s,得到的突变菌株AR1019-4效价为547.78 mg/L,较原始菌株增加了21.88%。以ARTP诱变得到的高产突变菌株AR1019-4为出发菌株,通过抗性突变筛选技术筛选获得1 152株突变株,其中13株突变菌株的效价较出发菌株增加10%以上,且2株效价较出发菌株增加15%以上,在0.5 mg/L的氯霉素平板上得到的突变菌株Chl 1215-5效价为637.12 mg/L,较出发菌株增加了16.31%;12 mg/L的庆大霉素抗性突变筛选到了突变菌株Gen 1207-8,效价为597.59 mg/L,该菌株的Spinosyn D组分由10%～15%增加至30%～35%左右,经遗传稳定性试验验证,突变菌株Chl1215-5和Gen1207-8可稳定遗传。试验结果表明ARTP诱变、紫外诱变和抗生素突变技术对选育多杀霉素高产菌株具有重要意义。     

可得然胶高产菌株的亚硝基胍诱变育种及其发酵条件的优化

[目的]研究用亚硝基胍(NTG)对产可得然胶菌株进行诱变育种及发酵条件优化,为可得然胶产量提升的研究提供参考。[方法]以土壤杆菌HS615(Agrobacterium sp.)为出发菌株,通过NTG诱变筛选高产菌株,再利用单因素和正交试验设计优化发酵培养基,提高得率。[结果]根据致死率确定了NTG的诱变条件为0.5 mg/mL,NTG处理30 min。其次根据菌落颜色和大小确定了初筛平板培养基为1.0%葡萄糖,0.2%酵母粉,0.05%苯胺蓝,初始pH为7.0。经过NTG诱变得到1株可得然胶得率比出发菌株高11.79%的高产菌株。单因素和正交试验设计优化发酵培养基成分为11.0%蔗糖,0.3%玉米浆,0.2%KH_2PO_4,0.2%K2HPO4,0.2%NH_4Cl,0.2%CaCO_3,0.1%MgSO_4·7H_2O,此时可得然胶得率为5.67%,比优化前提高了6.78%,比初始产量提高了19.37%。[结论]该研究可为可得然胶高产菌株筛选及发酵条件优化提供参考依据。     

产β-甘露聚糖酶菌株育种及培养基优化

利用实验室筛选保藏最高酶活为10.7 U/mL的白腐真菌作为出发菌株,进行紫外诱变育种及培养基优化,以期提高菌株产β-甘露聚糖酶能力.结果表明,紫外诱变条件为孢子悬液浓度106～107个/mL,诱变时间10 min,此条件下的孢子致死率达78％,获得了13株正向突变株,经6代遗传稳定性试验证明UV-2突变株酶活最高,遗传稳定性最强,比出发菌株酶活提高了2.075倍.通过单因素试验确定了该突变株的最佳碳源、氮源分别为魔芋粉和硝酸铵,对酶活影响较大的无机盐为磷酸二氢钾.通过正交试验,确定了最佳产酶培养基为魔芋粉4.0 g/L、NH4NO3 5.0 g/L、KH2PO4 5.0 g/L、NaCl 1.0 g/L、MgSO4·7H2O1.0 g/L,在此条件下测得甘露聚糖酶最大酶活为46.17 U/mL,比优化前提高了40.3％.     

紫外线和亚硝基胍对益生菌FGM发酵提取黄芪多糖的影响

旨在评价紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变处理对菌株FGM发酵提取黄芪多糖的影响。分别用适量UV、NTG、UV+NTG诱变处理对数生长期的益生菌株FGM,筛选生长性能较好的诱变株发酵中药黄芪,水提醇沉发酵产物中的粗多糖,苯酚―硫酸法测定多糖质量分数。结果显示,UV处理90s得到的诱变菌株U90发酵黄芪后,产物中多糖质量分数比其他诱变剂量较高,为235.51mg/g,与诱变前相比增加58.13%;1.0g/L的NTG处理菌株10min后,得到的诱变株N1-1发酵黄芪后,产物中多糖质量分数比其他剂量高,为161.2mg/g,与诱变前比较增加10.64%;UV照射10s后,再用1.0g/L的NTG处理10min,得到的诱变菌株UN10-1发酵黄芪后,产物中的多糖质量分数为293.39mg/g,较诱变前增加了94.99%;UV照射10~120s所得的菌株发酵黄芪后产物中多糖质量分数均呈升高趋势,而NTG处理所得菌株发酵黄芪后产物中多糖质量分数变化无规律性。由此可见,UV和NTG诱变均有改善益生菌株FGM发酵提取黄芪多糖的作用,但NTG改善菌株发酵性能不明显,适量UV照射结合一定浓度NTG诱变所得的菌株发酵提取黄芪多糖的性能优于UV和NTG单独作用。     

亚硝基胍诱变丙酸杆菌选育高产抑菌物质菌株

[目的]提高丙酸杆菌代谢物的抑菌活性,为薛氏丙酸杆菌代谢物的工业化生产奠定基础。[方法]以实验室保藏的薛氏丙酸杆菌H1310为出发菌株,采用亚硝基胍(NTG)进行诱变处理,待突变菌株长出后采用双层平板筛选法进行筛选,而后通过深层液体发酵对筛选到的菌株进行复筛。[结果]当最优的NTG诱变浓度为0.3 mg/m L时,致死率为90.69%。采用双层平板法,从3 564株菌落中挑选出87株突变株,进一步进行复筛,获得一株突变菌株,其代谢物抑菌活性达(28.30±2.47)AU/m L,比出发菌株提高43.87%。[结论]确定了丙酸杆菌NTG诱变选育的试验方法,获得一株抑菌活性高的遗传性能稳定的菌株。     

L-缬氨酸产生菌JVHK597的选育及无机盐对其产酸量的影响

[目的]筛选L-缬氨酸高产菌株并研究其发酵条件。[方法]以黄色短杆菌（Brebvibacterium flavum）突变株ZGH6128为出发菌株,采用紫外线（UV）、硫酸二乙酯（DES）和亚硝基胍（NTG）3种诱变剂进行诱变处理,通过摇瓶培养筛选出L-缬氨酸高产突变菌株。[结果]经过UV、DES和NTG 3种诱变剂处理菌株ZGH6128,逐步获得菌株JVHK597,并具有Leu营养缺陷、Ile营养缺陷、Met营养缺陷、α-AB抗性、2-TA抗性5种遗传标记。在未优化的条件下,菌株JVHK597摇瓶发酵72 h的产酸量达41.2 g/L。8次传代试验结果表明,菌株JVHK597的产酸能力稳定,经鉴定,菌株JVHK597的基因型为（Leu-,Ile-,Met-,α-ABr,2-TAr）,遗传标记具有稳定性。发酵培养基中硫酸镁（MgSO4.7H2O）和磷酸二氢钾的含量分别为0.6和1.4 g/L时,最有利于菌株生产L-缬氨酸。[结论]试验筛选出了L-缬氨酸高产菌株JVHK597,并为其发酵培养提供了指导。     

NTG-LiCl复合诱变选育链霉菌702菌株

为筛选出产新农抗702的高产链霉菌702突变株.分别以链霉菌702菌株为试验材料和以庆大霉素为敏感抗生素,NTG-LiCl复合诱变链霉菌702菌株,获得抗庆大霉素突变株.NTG处理90 min对菌株的致死率可达71.56%,抗药性突变率高达19.46%,获得的抗药性突变株经过摇瓶初筛和复筛,获得高产突变株13-18-52菌株,产抗新农抗702的摇瓶发酵单位达到1 946 μg/mL,比出发菌株发酵单位1 416 μg/mL提高了37.43%.采用抗药性致死突变标志的NTG-LiCl复合诱变筛选模型可以获得产新农抗702的链霉菌702高产菌株.     

钩丝孢属真菌高产蛋白酶菌株的筛选及其发酵条件优化

【目的】筛选钩丝孢属真菌高产蛋白酶菌株,并优化其产酶培养基和发酵条件,为寄生线虫病的生物防治提供优良菌种。【方法】以15株钩丝孢属真菌为材料,在28℃、180 r/min振荡培养10 d后,采用福林酚法测定其蛋白酶活性,筛选高产蛋白酶菌株,测定其产酶周期,并利用全齿复活线虫测定该菌株发酵液的杀线虫率。通过单因素试验和正交试验对高产蛋白酶菌株的产酶培养基及发酵条件进行优化,并对优化条件进行验证。【结果】从15株钩丝孢属真菌中筛选出1株高产蛋白酶菌株H6,其蛋白酶活性在发酵5 d最高。最佳产酶培养基成分为葡萄糖8 g/L、明胶8 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母提取物4 g/L。最佳发酵条件为pH 7.0、20℃、260 r/min、接种2块直径5 mm的菌块。在此优化条件下,菌株H6蛋白酶活性为216.42 U/mL,比优化前(67.84 U/mL)提高了2.19倍。【结论】筛选出1株钩丝孢属高产蛋白酶菌株H6,获得了其优化产酶培养基和发酵条件。     

透明质酸产生菌的诱变选育及发酵工艺的研究

研究了透明质酸产生菌兽疫链球菌的诱变筛选及摇瓶发酵条件.通过紫外线和NTG复合诱变处理得到溶血性弱的菌株,突变菌株比出发菌株透明质酸产量提高1倍以上.同时,对摇瓶发酵条件进行了优化,确定了最佳发酵培养基、最适反应温度、最适pH、碳源及氮源的选择.     

Tn5转座诱变选育冠菌素耐高温生产菌株及其发酵条件研究

利用双亲接合的方法将含有Tn5转座子的质粒pRL1063a导入丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syingae pv. glycinea）PG4180中,在含有卡那霉素和链霉素的MG平板上筛选抗性接合子。通过诱变,从874个突变株中筛选得到2株高温下产生冠菌素的突变株MFB132和MFB141。进而对菌株MFB141的发酵条件进行了优化,其最佳发酵条件为：2%葡萄糖为碳源,0.1%氯化铵为氮源,培养基初始pH为6.8,装液量为50 mL / 500mL,接种量为2%,发酵温度由原来的18℃上升到28℃,而发酵时间由原来的168 h缩短到108 h。在最优化条件下,出发菌株28℃下冠菌素产量仅为1.8 mg/L,而突变株MFB141在28℃下的产量达到37.66 mg/L,大约是出发菌株的21倍。     

丙酮丁醇梭菌复合诱变及发酵废弃物原料产生物丁醇的研究

[目的]通过废弃资源的再利用研究可替代的新型生物燃料——丁醇的发酵培养基。[方法]对菌株Clostridium acetobutylicum CGMCC 1.0134进行紫外诱变和磁场与Fe~(2+)共同诱变,获得1株丁醇产量高和稳定性好的优良突变株Clostridium acetobutylicum UM-80,采用不同的废弃原料考察该突变菌株的发酵性能,并筛选出合适的性价比高的培养基。[结果]突变株UM-80发酵产丁醇和总溶剂(丙酮、丁醇、乙醇)分别为9.04、17.95 g/L,较原始菌株分别提高了5.12%、4.12%。单独的蕨根是较好的丁醇发酵原料,当蕨根醪质量分数为15%时发酵液中丁醇浓度最高为5.50 g/L。当高山被孢霉与蕨根共同发酵时发酵液中丁醇最高产量为6.50 g/L。[结论]蕨根与高山被孢霉的复合培养基是较好的生物丁醇发酵培养基。     

产辅酶Q_(10)根瘤土壤杆菌的紫外诱变选育及其发酵培养基优化

以根瘤土壤杆菌作为出发菌株,经过紫外诱变、平板初筛、摇瓶发酵复筛,最终获得1株辅酶Q_(10)高产菌株Q-6,其辅酶Q_(10)产量为11.92 mg/L,较出发菌株提高92.57%,且其遗传性稳定,可用于进一步研究。然后在单因素试验的基础上,应用响应面分析方法,对其发酵培养基进行优化,得到生产辅酶Q_(10)的最佳发酵培养基配方(葡萄糖35.46 g/L、酵母浸膏12.33 g/L、Na_2HPO_41.58 g/L、MgSO_4·7H_2O 0.39 g/L),在此培养基下辅酶Q_(10)产量最高,为11.32 mg/L,较单因素试验最高值提高8.53%。     

复合诱变选育丙酮丁醇梭菌发酵玉米秸秆水解液

[目的]提高丙酮丁醇梭菌CICC8012产丁醇能力。[方法]采用紫外线和甲基磺酸乙酯（EMS）复合诱变选育丙酮丁醇梭菌CICC8012。[结果]紫外辐照120 s,5%EMS处理60 m in条件下,筛选得到1株遗传稳定性良好的高产突变株M-31,其在葡萄糖培养基中总溶剂产量10.39 g/L,丁醇产量6.55 g/L,较出发菌株分别提高了16.48%和20.62%。对M-31玉米秸秆水解液发酵培养基进行优化,得到最优工艺组合：初始水解糖浓度为80 g/L,（NH4）2SO43 g/L,KH2PO40.6 g/L,MgSO4.7H2O 0.4 g/L,FeSO4.7H2O 15 mg/L,并选择亚硫酸盐法对秸秆水解液进行脱毒,丁醇和总溶剂产量分别达到5.19和8.27 g/L,较优化前分别提高了55.39%和55.74%。[结论]得到的高产突变株较出发菌株丁醇产量更高、更适合于生物质发酵。     

抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选

以绿僵菌为实验材料,在添加了溴氰菊酯的培养基内对其进行NTG、紫外以及NTG与紫外复合诱变。实验结果表明,最佳诱变组合为NTG浓度为0.04g/L、处理时间15m in,紫外诱变的处理时间10m in。在该诱变条件下筛选出一株对溴氰菊酯有一定抗性的绿僵菌菌株。     

纳他霉素高产菌株的诱变选育

以褐黄孢链霉菌(ATCC13326)为出发菌株,紫外诱变后,结合链霉素抗性筛选法选育纳他霉素高产菌株.原始菌株活化后,测定其最小链霉素抑制质量浓度为8 μg/mL.采用90% 的紫外致死剂量,照射108 mL-1 ATCC13326孢子悬液,诱变后涂布于8 μg/mL链霉素选择培养基上,筛选链霉素抗性突变株.通过形态指标初步选择5株突变株进行发酵性能测定,种子培养26 h,摇瓶发酵96 h,用紫外分光光度计在303 nm下测定其吸光值,计算纳他霉素发酵产量.结果表明原始菌株纳他霉素发酵产量为1.229 g/L,诱变获得的两株高产突变株纳他霉素发酵产量分别为1.552和1.776 g/L,分别高出原始菌株26.3%、44.5%.     

高效秸秆降解菌株的分离与选育

为了选育高效降解玉米秸秆的菌株,首先用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基结合滤纸条无机盐培养基,对从样品中分离的菌株进行初筛,再以玉米秸秆培养基复筛并进行发酵产酶试验,测定CMC-Na酶活和FPA酶活,最后对目的菌进行紫外诱变。通过筛选得到降解效果较好的2株真菌PJ-2、PJ-4和1株放线菌GJ-1。紫外诱变后获得正向突变菌3株,分别为PJ-2的突变菌UV-1-1,PJ-4的突变菌UV-2-2和UV-2-4,这3株突变株的CMC-Na酶活力相对原菌株分别提高45%、20%和10%以上,菌株降解秸秆能力也显著提高。     

NTG诱变筛选高产柚苷酶抗药性突变株

通过筛选柚苷酶产生菌3-54菌株孢子的敏感抗生素最低致死浓度,采用NTG对出发菌株孢子进行诱变处理,将诱变后的孢子涂在含纳他霉素致死浓度(2.0 U/mL)的平板筛选培养基上,获得了大量的抗药性致死突变株。再结合透明圈法,经过透明圈初筛和多次摇瓶复筛,从180个纳他霉素抗性基因突变株中筛选得到1株摇瓶发酵单位达770.06 U/mL的3-54-NTG-16号菌株,比出发菌株的产酶能力提高了近100%。     

TiCl_3法快速筛选L-苹果酸高产突变株

[目的]探讨并验证TiCl3法筛选L-苹果酸高产突变株的可行性。[方法]将34株米根霉诱变株及出发株(CK)分别接种到含葡萄糖的发酵培养基中发酵96 h,发酵液经稀释后加入TiCl3,根据沉淀发生情况,筛选L-苹果酸高产突变株。[结果]当发酵液稀释40倍时,有4株诱变株发酵液产生沉淀,而出发株发酵液未产生沉淀。据此筛选出4株发生显著正突变的诱变株,其L-苹果酸产量约为16~20g/L。其发酵液经HPLC测定分析,表明4株突变株发酵液中L-苹果酸的产量为15.88~18.26 g/L,而出发株L-苹果酸产量为11.76 g/L,突变株L-苹果酸产量增幅达35%~55%。[结论]TiCl3法可有效应用于L-苹果酸高产突变株的筛选。     

西方许旺酵母菌产双加氧酶的发酵条件研究

将1株西方许旺酵母菌株应用于降解类β-胡萝卜素产生香味物质的体系中,为生物技术制备香精香料提供研究基础,对其液态发酵培养基及发酵条件进行优化,确定纯种液态发酵最佳培养基组分及发酵条件。以西方许旺酵母为试验菌株,采用摇瓶发酵的方式,研究培养基组分(碳源、氮源、无机盐离子)及添加量与发酵培养条件(温度、初始pH值、接种量、摇床转速)对菌种产双加氧酶的情况。结果表明,培养基最优组成为10.00 g/L葡萄糖、10.00 g/L蛋白胨、5.00 g/L酵母粉、0.20 g/L FeSO_4、0.45 g/L Mg SO4·7H_2O、3.00 g/L Na NO_3、0.50 g/L KCl;最佳优化条件为温度27.90℃、起始pH值为7.21、转速为160.00 r/min、接种量为5.00%,发酵时间为72.00 h,此时酶活性达到1.23 U/m L,5次中心点重复试验结果稳定可靠;通过响应面分析发现,温度、起始pH值作用极显著,温度和起始pH值交互显著,客观反映了微生物的发酵条件。     

农用抗生素产生菌No.24菌株诱变选育研究

以No．24菌株为出发菌株，采用紫外线、化学试剂、微波及超声波诱变法对其进行诱变。其中经微波诱变50s后，筛选得到一株高产菌株，命名为Ms-24菌株。在培养基中连续培养10代，其遗传性状非常稳定。Ms-24菌株发酵试验证明，其发酵产量比出发菌株提高23．25％；抗菌活性试验证明，其发酵液的抗菌活性比出发菌株提高了31．75％。