高表达粟酒裂殖酵母SpTrz2p对细胞周期的影响

[目的]测定粟酒裂殖酵母高表达的SpTrz2p对其细胞周期的影响。[方法]将粟酒裂殖酵母的trz2+克隆到pREP4x质粒上,构建带有SpTrz2的高表达载体,将构建成功的重组子转化至野生型粟酒裂殖酵母细胞中,利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。[结果]高表达SpTrz2p可导致酵母细胞形态和周期的改变,使大部分酵母细胞停留于G1期,这说明高表达SpTrz2p对细胞周期有明显影响。[结论]该研究结果表明高表达SpTrz2p给细胞造成的致死毒性是通过影响细胞周期实现的。     

三黄鸡STING胞外区基因克隆及原核表达

[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体.     

应用Intein融合的鸡IL-2蛋白制备多克隆抗体

研究Intein标签与目的蛋白chIL-2融合作为抗原,进行高效价兔抗chIL-2蛋白多克隆抗体的制备,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366 bp)克隆连接到p TYB1原核表达载体,将chIL-2基因与1 362 bp的Intein基因融合在同1开放阅读框内,编码分子量约为71 ku的chIL-2-Intein融合蛋白。诱导表达chIL-2-Intein融合蛋白,应用Chitin-Sepharose亲和层析进行融合蛋白纯化。用纯化的chIL-2-Intein融合蛋白免疫大白兔制备多克隆抗体。应用昆虫细胞表达系统纯化出的chIL-2-6His蛋白作为抗原,包被ELISA板用于抗体效价的检测,Western Blot分析抗体特异性。结果表明:应用纯化的chIL-2-Intein融合蛋白成功制备特异性chIL-2抗体,效价高达4 096 000,且该抗体也能用于Intein标签蛋白的检测。     

延边白鹅IFN-γ基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备抗延边白鹅IFN-γ蛋白的多克隆抗体,以已制备的pMD-IFN-γ质粒为模板,通过PCR扩增到延边白鹅IFN-γ基因,经TA克隆和BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将目的基因亚克隆至pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,将经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确的重组蛋白用GST标签纯化试剂盒纯化,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行ELISA检测。结果显示,成功构建了原核表达载体p GEXIFN-γ,表达的重组蛋白以包涵体形式存在,分子质量约为43 ku,制备的小鼠抗IFN-γ多克隆抗体效价为1∶16 000。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株N基因在大肠杆菌中的表达及产物免疫活性检测

鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白(N)基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL-p2X,构建重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达。通过pMALTM融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA法检测其生物活性。结果表明,表达的重组核蛋门纯化后出现2条带,相对分子质量分别约为92和82 ku,与Western blot出现的2条蛋白带一致;纯化的重组蛋白经裂解因子作用后,出现2条蛋白带,相对分子质量分别为45和35 ku,与预期结果相符合;制备的多克隆抗体可与不同鸡传染性支气管炎病毒株发生反应,与亲本毒株的反应性略高于与其他毒株的反应性。以上结果表明,原核表达的可溶性N蛋白具有高度的生物活性,有望作为新的基因工程抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的群特异性诊断。     

猪瘟E2基因多克隆抗体的制备及其特性分析

以CSFV FJ-1株为模板对猪瘟E2基因的主要抗原表位进行PCR扩增,得到大小为370bp的目的片段,将其连接到pET-32a表达载体,转化BL21后利用IPTG诱导其表达,SDS-PAGE和Western blot分析表明,目的蛋白成功获得表达,大小约33.5ku融合蛋白。利用Ni-NTA agarose纯化蛋白、重组蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化后免疫新西兰兔,多克隆抗体效价经间接ELISA检测可高达1∶6400。Western blot结果表明该重组蛋白具有良好的反应原性,试验结果表明已成功获得猪瘟E2基因的多克隆抗体且能识别CSFV FJ-1毒株。     

边缘革蜱Dm 86基因表达及免疫原性分析

【目的】 研究Bm86同系物Dm86基因及其编码蛋白,为抗边缘革蜱疫苗候选抗原提供基础。【方法】 以边缘革蜱饱血雌蜱cDNA为模板扩增克隆Dm86基因,分析生物学特性及生活史各阶段表达水平,截短基因构建重组质粒,经IPTG诱导后SDS-PAGE鉴定,纯化蛋白,制备多克隆抗体进行Western Blotting 鉴定。【结果】 PCR扩增获得了1 773 bp目的片段,Dm86蛋白由591个氨基酸组成,分子量为64 857.81,理论等电点为6.78,酸性,具有不稳定性、亲水性和多个B细胞抗原表位;Dm86基因在边缘革蜱不同阶段均有不同程度的表达,饱血蜱阶段的表达量较高;重组蛋白大小为39kDa,以包涵体形式表达;抗体效价可达1∶25 600,能够识别重组蛋白。【结论】 Dm86重组蛋白具有一定的反应原性和免疫原性。     

山羊SOX2多克隆抗体制备

【目的】构建山羊 Sox2 原核表达载体-pRSET-Sox2,并将诱导表达、纯化的 His-Sox2 融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备 Sox2 多克隆抗体。【方法】从 pMD18T-Sox2 载体上以 Bam H I和 Xho I 双酶切截取 Sox2 片段,然后将其亚克隆到 pRSET-A 表达载体上,获得 pRSET-Sox2 重组质粒。转化了 pRSET-Sox2 的大肠杆菌 BL21(DE3),1 mmol•L-1 IPTG  37℃ 诱导 4 h,SDS-PAGE电泳及 Western blotting 检测融合蛋白表达。相同条件下大量增菌诱导,用Ni- NTA argrose 介质分离纯化 His-Sox2 重组蛋白。将体外复性的融合蛋白皮下注射新西兰大白兔,间隔 2-3 周注射一次,共 4 次。最后一次注射后 7 d,采血分离血清,用 Western blotting 检测抗体特异性。【结果】（1）原核表达载体 pRSET-Sox2 在大肠杆菌 BL21(DE3) 得到了高效表达;（2）纯化的 His-Sox2 融合蛋白能够满足多克隆抗体制备的要求;(3)经 Western blotting 检测,Sox2 多克隆抗体能与 His-Sox2 融合蛋白特异性结合。【结论】制备了高特异性山羊 Sox2 多克隆抗体,为深入探讨山羊 Sox2 基因的生物学功能奠定了基础,也为山羊（iPS）细胞检测创造了良好条件。     

南芥菜花叶病毒衣壳蛋白的克隆、原核表达和多克隆抗体制备

为开发百合中南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)的血清学检测技术及研究ArMV的致病机理,原核表达ArMV衣壳蛋白(coat protein, CP),纯化并制备其多克隆抗体。以侵染东方百合杂交品种‘木门’(‘Conca D’or’)的ArMV基因组为模板,克隆ArMV CP基因全长,构建ArMV CP基因原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)原核表达ArMV CP蛋白,并以纯化ArMV CP蛋白为抗原制备兔抗多克隆抗体,Western blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果表明:克隆获得百合ArMV CP序列(GenBank登录号:MT323117)全长,其长度为1 515 bp,与已知的ArMV CP基因核苷酸序列相似性最高达到93.6%,氨基酸序列相似性最高达到98.2%;SDS-PAGE表明CP蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量表达,蛋白相对分子质量为56 ku; Western blot结果显示抗体能够特异性结合ArMV CP蛋白,具有良好的特异性。     

黄颡鱼长型肽聚糖识别蛋白(pfPGRP-L)原核表达和多克隆抗体的制备

为进一步研究肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)在先天性免疫应答中的生物学功能,在前期克隆黄颡鱼长型肽聚糖识别蛋白(pfPGRP-L)c DNA全长的基础上,根据pfPGRP-L基因中高亲水性区域序列设计特异性引物扩增出编码序列,将该基因片段克隆到p GEX-4T-1质粒,构建重组表达载体。SDS-PAGE电泳检测该目的蛋白大小约为51 ku,与理论值大小符合,回收蛋白并纯化,与弗氏佐剂等量混合后注射新西兰大白兔制备多克隆抗体,用ELISA和Western blotting分别检测该抗体,结果显示:抗体效价可达1∶256 000,且有特异性条带,表明pfPGRP-L的多克隆抗体制备成功。此外,Western blotting检测黄颡鱼不同组织pfPGRP-L蛋白的表达,发现在鳃、胸腺、肝脏、肾脏、头肾、脾脏、血液和肠道等不同组织中都有目的条带,而在脾脏和肠道中表达更强。为pfPGRP-L的抗菌作用和功能研究奠定基础。     

魔芋花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

采用小RNA测序技术对甘肃省榆中县疑似感染病毒病的当归[(Angelica sinensis(Oliv.)Diels]样品进行测序鉴定,发现样品中含有魔芋花叶病毒(Konjac mosaic virus,KoMV),通过反转录PCR(RT-PCR)扩增KoMV衣壳蛋白(capsid protein,CP)的cp基因,克隆的KoMV cp基因连接原核表达载体pET-28a(+),导入E.coli Rosetta^TM(DE3)诱导表达蛋白,在Ni-NTA重力柱层析作用下纯化CP融合蛋白,并以此作为抗原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。序列分析表明:KoMV cp基因片段大小为840 bp,编码280个氨基酸的外壳蛋白;与GenBank已注册同源性较高的KoMV分离物相比,核苷酸序列相似性为85.58%~99.41%,氨基酸序列相似性为89.32%~99.29%;KoMV的病毒种群分布存在明显的区域性和寄主差异。SDS-PAGE显示,不同温度诱导下KoMV CP融合蛋白在E.coli Rosetta^TM(DE3)中均以包涵体的形式大量表达,融合蛋白分子量为36 ku。间接ELISA和Western blot检测结果显示,制备的多克隆抗体效价达到32 000,能够与感染KoMV的当归叶片和纯化蛋白特异性结合,具有良好的特异性。本研究成功制备了当归KoMV CP融合蛋白的多克隆抗体IgG,为开发KoMV的血清学检测技术及CP蛋白的功能研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒Core蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的Core蛋白及其多克隆抗体,根据Core蛋白的编码基因序列,设计合成一对特异性引物,利用RT-PCR扩增BVDV Core基因并定向插入Pet30a载体中,构建重组质粒Pet30a-Core,经酶切鉴定后转化大肠埃希菌TOP 10感受态细胞,筛选获得阳性重组菌,以IPTG进行诱导后成功表达出分子质量为20 ku的重组Core蛋白。将诱导表达的蛋白产物经融合蛋白的Ni柱亲和法进行纯化,利用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA法测出多克隆抗体效价达到1∶512 000。蛋白质印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)证实,多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的免疫原性和特异性。本实验成功制备了BVDV重组Core蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV的检测及其Core蛋白功能研究奠定了基础。     

尼罗罗非鱼Hsc70的原核表达和多克隆抗体制备

通过原核表达系统表达尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,纯化该蛋白并制备其多克隆抗体。对尼罗罗非鱼热休克蛋白进行生物信息学分析,设计特异性引物,扩增出Hsc70基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,并转入大肠埃希菌B21中通过诱导剂IPTG进行原核诱导表达,表达产物用SDS-PAGE鉴定并用镍柱进行纯化。将纯化后的重组蛋白免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明,原核表达系统成功表达了尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,重组蛋白分子量约为75 ku,主要以包涵体形式表达。经镍柱纯化得到高纯度的Hsc70;该蛋白免疫日本大耳兔获得特异性多克隆抗体,效价为1∶2 048 000;Western blot检测到一条75 ku的特异性条带,表明该抗体能特异性地识别尼罗罗非鱼Hsc70蛋白。尼罗罗非鱼Hsc70蛋白在大肠埃希菌中成功表达,制备的重组蛋白和多克隆抗体为深入研究尼罗罗非鱼Hsc70的功能提供了分子工具。     

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。     

飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′的抗体制备及组织定位

【目的】LmKnickkopf3-5′(LmKnk3-5′)是飞蝗（Locusta migratoria）蜕皮发育中重要的表皮蛋白。本文旨在制备LmKnk3-5′特异抗体并对其进行组织定位,为LmKnk3-5′生物学功能研究提供蛋白水平的证据,同时为进一步深入探究LmKnk3-5′与其他表皮蛋白在飞蝗表皮形成过程中的协同作用打下基础。【方法】首先比对飞蝗Knickkopf(Knk)家族4个基因LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和LmKnk3-5′的氨基酸序列,选取LmKnk3-5′的3段特异抗原序列R1、R2和R3,设计包含BamH I、Hind III酶切位点的引物,以LmKnk3-5′全长cDNA为模板,PCR获得LmKnk3-5′的特异抗原片段;然后将特异抗原片段与pET-32a经双酶切、T4连接酶连接、测序验证、成功构建重组质粒后,转入BL21（DE3）表达菌株中,加入IPTG（终浓度0.5 mmol·L^-1）低温（16℃）诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况;接着扩大培养可在菌体裂解液的上清中表达重组融合蛋白的大肠杆菌,提取蛋白并用Ni-NTA对其进行纯化,之后再用纯化后的重组特异抗原免疫小鼠4次,获得anti-LmKnk3-5′多克隆抗体,ELISA法对其进行效价检测,并用Western blot法检测其特异性。取飞蝗5龄若虫第8天表皮,制备石蜡切片,通过免疫组化法对LmKnk3-5′蛋白进行组织定位。【结果】通过氨基酸序列比对,选取LmKnk3-5′的特异抗原区域R1、R2和R3,分别包含208、147和131个氨基酸残基,蛋白理论分子量分别为24.0、17.0和14.8 kD。酶切连接后,成功获得 pET-32a-R1、pET-32a-R2 和pET-32a-R3重组质粒。诱导表达检测,发现只有含pET-32a-R2的表达菌在菌体裂解液的上清液中大量表达重组蛋白。将其扩大培养纯化后获得 R2重组融合蛋白,免疫小鼠取抗血清进行效价检测,抗体效价高达1﹕512 000,可满足抗体使用需求。Western blot结果表明,注射dsLmKnk3-5′后飞蝗体壁LmKnk3-5′的蛋白表达显著减少,表明anti-LmKnk3-5′抗体特异性良好。免疫组化试验结果表明,表皮蛋白LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁皮细胞及新表皮中均有分布,特别是新合成的外表皮顶端。【结论】成功获得飞蝗LmKnk3-5′多克隆抗体,证明其特异性良好。LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁新合成的外表皮顶端分布较多。研究结果为飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′功能研究提供了蛋白水平的证据。     

车前草花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

为制备车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)及其多克隆抗体,采用RT-PCR方法从甘肃省种植的切花百合上克隆了PlAMV cp基因的部分序列,连接表达载体pET-28a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导和Ni-NTA重力柱层析获得了大量纯化的CP融合蛋白,将其作为抗原免疫家兔制备了多克隆抗体。序列分析结果表明,PlAMV cp基因片段大小为621 bp,编码207个氨基酸;与已注册的PlAMV分离物相比,核苷酸序列相似性为74.7%~100%,氨基酸序列相似性达到83.6%~100%;不同植物PlAMV的分离物序列差异明显,病毒种群分布呈现寄主差异。SDS-PAGE结果表明,CP蛋白在E. coli BL21(DE3)中大量表达,蛋白相对分子质量为24 ku。Western blot结果显示,抗体能够特异结合天然PlAMV病毒蛋白,可用于检测感病材料中PlAMV蛋白的表达量。本研究可以为PlAMV的血清学检测技术开发和致病机理研究提供一定的参考。     

拟南芥叶绿体血红素加氧酶AtHO1基因的克隆和多克隆抗血清制备

为研究叶绿体血红素加氧酶HO1的生物学功能和分子作用机制,构建了拟南芥血红素加氧酶基因AtHO1的重组融合蛋白表达载体pET28a-AtHO1,质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,AtHO1的重组融合蛋白获得了高效表达,分子质量为28～36ku,且为可溶蛋白。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析法纯化后,得到纯度较高的蛋白。纯化产物免疫新西兰大耳兔获得了专一识别重组蛋白6×His-AtHO1的抗血清,进一步提取拟南芥和水稻叶片总蛋白,蛋白质印迹检测显示,在分子质量28～36ku之间出现特异性条带,证明用重组蛋白6×His-AtHO1制备的多克隆抗血清可以与拟南芥和水稻HO1蛋白特异性结合,说明拟南芥HO1的抗血清能够用于水稻HO1的功能分析和应用研究。