笋瓜韧皮部特异性启动子的克隆分析及新型植物表达载体构建

根据已报道具韧皮部组织特异性的笋瓜韧皮部蛋白2（PP2）基因序列设计引物,以山西本地种笋瓜叶片基因组DNA为模板,用PCR法扩增得到了长度为966bp的PP2基因启动子片段,克隆入pUCm—T载体后,经鉴定获得了新的重组质粒pUCm—PSP,测序和序列分析表明与两个已报道的片段分别有95％和99％的同源性,推测具有相似的启动子功能。分别用限制性内切酶PstⅠ和BglfⅡ双酶切重组质粒pUCm—PSP和由CaMV35S组成型启动子驱动GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1302,分别回收pUCm—PSP重组质粒中的PSP小片段和pCAMBIA1302植物表达载体中去掉GFP报告基因上游CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动报告基因GFP的新型植物表达载体pHZ03。利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中,为进一步研究其表达功能奠定了基础。     

含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780的构建

[目的]构建含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。[方法]用PCR方法扩增psmGFP的GFP片段,BamHI和SacI双酶切PCR产物,同时用BamHI和SacI双酶切pBI121。从琼脂糖凝胶中回收纯化pBI121的大片段,经连接、转化、鉴定出改造后的质粒。[结果]用PCR方法扩增得到长度为740 bp的增强型的绿色荧光蛋白基因片段,克隆入pBI121表达载体后,获得了新的重组质粒pBI121-GFP。分别将编码拟南芥BAG7、BAG4蛋白的基因At5g62390和At3g51780通过PCR方法扩增后,克隆入pBI121-GFP,构建了用于超量表达BAG蛋白基因的GFP融合蛋白双元表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。利用细胞感受态法将该植物表达载体分别导入根癌农杆菌GV3101中。[结论]为进一步研究BAG蛋白在拟南芥抗性胁迫中的功能及其在细胞内的动态分布奠定了基础。     

耐盐柳树抗虫基因Cry3A重组表达载体的构建

将苏云金芽孢杆菌Cry3A类抗虫基因经Bam HⅠ、SalⅠ双酶切后与植物表达载体p CAMBIA1304-C6连接,构建p CAMBIA1304-C6-Cry3A重组表达载体,将其转化到农杆菌LBA4404中,同时进行双酶切、测序及PCR鉴定。结果表明:双酶切及测序产物与预期扩增片段相符,重组表达载体p CAMBIA1304-C6-Cry3A构建成功;农杆菌LBA4404中含有重组质粒,成功构建了Cry3A农杆菌基因工程菌株。     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301,并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt(潮霉素磷酸转移酶基因),经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

pBIN438-CMV △Rep表达载体的构建及其在根癌农杆菌中的转化

用PCR方法扩增黄瓜花叶病毒部分复制酶基因(CMV△Rep),连接到PUCm-T载体上构建成克隆载体PUCm-T-CMV△Rep。用Bam HⅠ和SalⅠ分别对克隆载体PUCm-T-CMV△Rep和植物表达载体p BIN438进行双酶切,获得目的片段和线性质粒。在T4 DNA连接酶的作用下进行定向连接,构建成植物表达载体p BIN438-CMV△Rep。采用Ca Cl2冻融法将重组子导入根癌农杆菌LBA4404。经PCR和双酶切鉴定,表明重组质粒p BIN438-CMV△Rep已成功导入根癌农杆菌中。     

植物afp表达载体的构建及其对农杆菌的直接转化

详细报道了胡萝卜抗冻蛋白基因 (afp)植物表达载体的构建过程及其直接法转化农杆菌的方法。以限制性内切酶从克隆载体上切取 afp基因 ,将其连接在相应酶切的 p BI12 1工程质粒上 ,构建成 afp植物表达载体。采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌 ,并用 PCR方法进行了鉴定     

重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究

对重组质粒导入农杆菌冻融法的几个技术环节进行改进与优化。结果表明：该方案可简便、快速、有效地将重组质粒导入农杆菌,转化效率高、重复性好。应用该改进和优化的标准冻融法将重组质粒pBISPl．pBIPl,pBIAP1和pBISgpl20分别导入根癌农杆菌EHAl05和LBA4404,构建了植物双元表达载体,为用农杆菌介导法进行植物遗传转化提供了良好的载体系统。     

植物afp表达载体的构建及其对农杆菌的直接转化

详细报道了胡萝卜抗冻蛋白基因（afp)植物表达载体的构建过程及其直接法转化农杆菌的方法，以限制性内切酶从克隆载体上切取afp基因，将其连接在相应酶切的pBI121工程质粒上，构建成afp植物表达载体，采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌，并用PCR方法进行了鉴定。     

志贺毒素B(ShT-B)亚单位基因的克隆、表达与纯化

用KpnⅠ和HindⅢ双酶切pGEM—TB3克隆质粒，得到为225bp成熟ShT—B基因片段，将其插入到经同样双酶切的pQE30表达载体中，构建了ShT—B的重组表达质粒pQE30-B2，转化到E．coli M15，经IPTG诱导后，重组质粒目的蛋白均得到表达表达蛋白约占菌体总蛋白的16％，主要为可溶性形式，约9．2％。为重组抗原的制备提供了必要的物质基础。     

蚯蚓纤溶酶基因番茄表达载体的构建

为研究蚯蚓纤溶酶的番茄表达,构建EFE基因的番茄表达载体pF和pEF,并导入农杆菌。采用PCR法在EFE基因DNA序列上添加了表达调控元件和酶切位点后,得到新EFE基因片段,将该片段与切去GUS基因的pBI121载体相连,以构建CaMV35S驱动的EFE组成型表达载体pF;用PCR克隆得到的E8启动子片段替换pF上的35S启动子,以构建番茄成熟果实特异性表达载体pEF;最后,采用三亲交配法用重组质粒转化根癌农杆菌EHA105;结果表明:经过酶切、PCR和测序鉴定,EFE基因、E8启动子序列已重组到表达载体上,植物表达载体构建正确,并且已经转化进农杆菌EHA105中。     

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中Os-WRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了该基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinG-FP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了OsWRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBinGFP-OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。     

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建(英文)

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中OsWRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了OsWRKY17基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinGFP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了Os-WRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBin-GFP/OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。     

高山离子芥冷诱导基因转化甘蔗二元植物表达载体构建

[目的]利用载体重组技术分别将高山离子芥冷诱导基因(Cbcor15a)和报告基因eGF插入载体pCambia1300-bar,并引入玉米泛素基因启动子UBi-1代替载体本身启动子CaMV 35s,重组为适合甘蔗转基因的二元植物表达载体pCambia 1300-cbcor 15a-bar.[方法]参照pCambia1300-bar载体多克隆位点和基因Cbcor15a、eGFP和启动子UBi-1的核苷酸序列设计引物,通过载体重组技术将基因和启动子分别插入相应的位点.利用基因枪分别将pCambia1300-bar载体和重组载体导入洋葱表皮细胞,用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察.[结果]与导入pCambia 1300-bar载体的洋葱表皮细胞相比较,导入重组载体pCambia1300-cbcor15a-bar的洋葱表皮细胞内有强烈的绿色荧光信号.[结论]重组甘蔗转基因二元植物表达载体启动子Ubi-1能够调控下游冷诱导基因Cbcor15a和报告基因eGFP的正常高效表达,为外源基因Cbcor15a转化甘蔗提供保障.     

玉米特异表达启动子驱动下结核esat-6抗原基因植物表达载体的构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Esat-6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,将globulin-1-Esat6联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中,构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GEsat-6,电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中.通过对pC1300GEsat-6质粒酶切鉴定和测序分析表明克隆的Esat-6与预期相符,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合.     

番茄乙烯形成酶基因的克隆及其反义基因的表达载体构建

从成熟的番茄果实中提取总ＲＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增合成乙烯形成酶ｃＤＮＡ,并将其克隆至载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ的ＥｃｏＲＶ位点,经限制酶谱分析,构建亚克隆进行全序列测定和序列分析。将所克隆基因以反义基因的形式定向重组到载体ｐＳＰＲＯＫ上,同时将带有完整启动子和终止子的标记基因ＢＡＲ基因引入ｐＳＰＲＯＫ中,最终获得表达乙烯形成酶反义基因和ＢＡＲ基因的植物表达载体ｐＢＡＲ－ＥＦＥ。     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

AtDREB2B基因的克隆及植物表达载体的构建

[目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenBank上登录AtDREB2B基因序列的一致性为100%。进一步通过片段的亚克隆,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301和pBin438上,分别由rd29A启动子和重复35S启动子调控基因表达。[结论]成功构建了2种AtDREB2B的植物表达载体,并通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,为农杆菌介导的AtDREB2B基因对植物的遗传转化奠定基础。